基因過表達

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基因功能研究中通常需要上調(diào)目的基因的表達來觀察表型的變化。過表達是將目的基因在宿主細胞大量表達的過程，其基本原理是將目的基因構(gòu)建到工具載體上，導(dǎo)入細胞使基因?qū)崿F(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而實現(xiàn)基因產(chǎn)物的過表達。工具載體通常包括原核表達載體、普通真核表達載體、慢病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。

工具載體介紹

根據(jù)實驗需要不同，目的基因大小等選擇不同的載體，包括真核表達載體和病毒載體等均可以實現(xiàn)編碼基因和非編碼基因的過表達。

表達系統(tǒng)	真核表達載體	慢病毒載體	重組腺相關(guān)病毒載體	重組腺病毒載體
載體基因特性	雙鏈DNA質(zhì)粒	RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒	單鏈DNA病毒	雙鏈DNA病毒
外源基因表達時間	24h開始表達，持續(xù)3-7天	2-4天開始表達，長時間穩(wěn)定表達	7-14天開始表達	1-2天開始表達
插入片段大小	8kb左右	4kb左右	2.8kb左右	4kb左右
穩(wěn)定細胞株篩選	難操作	可以	不可以	不可以，瞬時表達
細胞實驗	細胞系，部分轉(zhuǎn)染效率低	首。閆祝腥拘矢	細胞系，部分血清型轉(zhuǎn)染效率低	廣譜，感染效率高
動物實驗	不適合	適合，根據(jù)觀察時間和注射部位	首選，根據(jù)觀察時間和注射部位	免疫原性高，慎選
滴度范圍	無	10⁸~10⁹TU/ml	10¹²-10¹³VG/ml	10¹⁰-10¹¹PFU/ml

載體圖譜中常見元件介紹

元件名稱	類型	用途
啟動子	CMV、CAG、EF1a、U6等	廣譜或特異啟動目的基因的表達
啟動子	hSyn、CaMKIIα等	特異性啟動子，在特定的組織細胞中啟動目的基因的表達
蛋白標簽	3xFLAG、HA 、6xHis、Myc等	與目的基因融合表達，常用于檢測外源蛋白表達水平
熒光標記	EGFP、mCherry、mNeonGreen等	可與目的基因融合或非融合表達用于檢測轉(zhuǎn)染、感染效果
抗性基因	Puro、Neo、Hygro、BSD等	真核抗性，常用于穩(wěn)定株篩選
抗性基因	Amp、Kan	原核抗性，常用于原核細菌培養(yǎng)，質(zhì)粒擴增
連接元件	Linker	用于連接兩個基因，融合表達時常用，可降低因融合表達對蛋白折疊和功能的影響
連接元件	IRES、2A	用于連接兩個基因，達到非融合表達的效果
其它元件	WPRE	增加目的基因的表達

載體選擇（部分）

病毒載體的選擇，根據(jù)實驗的需求參考慢病毒、腺相關(guān)病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。

載體類別	編號	載體元件
慢病毒過表達	GL127	pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE
	GL121	pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPRE
	GL107	pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE
	GL122	pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPRE
	GL124	pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE
腺病毒過表達	H225	pADV-mCMV-MCS-3xFLAG
	H201	pADV-mCMV-EGFP-3xFLAG
	H213	pADV-mCMV-3xFLAG-EGFP
	H204	pADV-mCMV-mCherry-HA
腺相關(guān)病毒過表達	AOV024	pAAV-CMV-EGFP-P2A-3xFLAG-WPRE
	AOV025	pAAV-CMV-mCherry-P2A-3xFLAG-WPRE
	AOV064	pAAV-hSyn-EGFP-P2A-3xFLAG-WPRE
	AOV065	AAV-hSyn-mCherry-P2A-3xFLAG-WPRE
	H9429	pAAV-CAG-EGFP-3xFLAG-tWPA
	H9525	pAAV-CMV-EGFP-3xFLAG-tWPA
	H10881	pAAV-CAG-EGFP-3xFLAG-tWPA
	H10886	pAAV-CMV-EGFP-3xFLAG-tWPA