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疾病研究（心、肝、肺）

疾病研究（心、肝、肺）

疾病研究（心、肝、肺）

　　基于對(duì)病毒載體的深入了解和研發(fā)，越來(lái)越多的科研人員開(kāi)始借助病毒載體進(jìn)行疾病研究。目前，病毒載體工具在不同組織器官中均有大量的應(yīng)用，通過(guò)使用工具病毒載體，對(duì)疾病相關(guān)基因進(jìn)行定向和組織特異性的改造和操控，已成為科研人員進(jìn)行疾病研究與治療的一種技術(shù)手段。

　　病毒載體的選擇

　　不同病毒載體的大小迥異，意味著其內(nèi)含基因容量存在巨大差異；免疫原性的不同，意味著其體內(nèi)/體外應(yīng)用的場(chǎng)景需要細(xì)微調(diào)整；表達(dá)時(shí)間和周期的不同，意味著九游會(huì)j9需要根據(jù)研究需求進(jìn)行相對(duì)應(yīng)的選擇。

表1 不同病毒的生物學(xué)特性比較

	慢病毒	腺相關(guān)病毒	腺病毒	逆轉(zhuǎn)錄病毒
包膜	有	無(wú)	有	有
顆粒直徑	80-100 nm	20-30 nm	90-100nm	~100nm
基因組	dsRNA	ssDNA	dsDNA	RNA
基因組大小	9.75kb	4.7kb	36kb	~5kb
表達(dá)起始時(shí)間	48-72h	72-96h	24-48h	48-72h
表達(dá)持續(xù)時(shí)間	> 2 months	> 6 months	< 1 month	> 2 months
體內(nèi)擴(kuò)散能力	一般	強(qiáng)	強(qiáng)	一般
免疫原性	中等	極低	強(qiáng)	中等
滴度范圍	10⁸~10⁹TU/mL	10¹²-10¹³VG/mL	10¹¹-10¹²PFU/mL	10⁷~10⁸TU/mL
滴度檢測(cè)方法	qPCR整合DNA	qPCR非整合DNA	抗原抗體免疫染色試劑盒	qPCR整合DNA
整合方式	隨機(jī)高頻整合	定向低頻整合（rAAV不整合）	非整合	隨機(jī)整合
應(yīng)用范圍	體外細(xì)胞感染，gRNA文庫(kù)篩。迥	基于不同的血清型，體內(nèi)廣泛應(yīng)用	嗜肝，快速表達(dá)或短期表達(dá)，血液、心臟，細(xì)胞系等	特異性只感染分裂期的細(xì)胞

　　重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV），一直是體內(nèi)研究的明星載體，除了其免疫原性極低、安全性高、宿主細(xì)胞范圍廣、擴(kuò)散能力強(qiáng)、體內(nèi)表達(dá)基因時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)外，還在于其種類多樣性。

　　現(xiàn)在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因組與不同的衣殼蛋白結(jié)合產(chǎn)生的混合體病毒載體，一般標(biāo)記為rAAV2/N (N為不同的衣殼血清型)。重組的病毒具有AAV2型的穩(wěn)定表達(dá)和基因整合能力，同時(shí)獲得了不同血清型的組織感染嗜親性，表現(xiàn)出一定的器官靶向特異性。

表2 不同血清型AAV的組織嗜親性

血清型	組織親和性
rAAV2/1	神經(jīng)系統(tǒng)（高滴度順向跨突觸），肌肉，骨骼。募。交
rAAV2/2	神經(jīng)系統(tǒng)，肌肉，肝臟，血管平滑肌，眼
rAAV2/3	肌肉，肝臟，肺，眼
rAAV2/4	神經(jīng)系統(tǒng)，肌肉，眼，腦
rAAV2/5	神經(jīng)系統(tǒng)，肺，視網(wǎng)膜，肝臟，滑膜關(guān)節(jié)
rAAV2/6	神經(jīng)系統(tǒng)，肺，肌肉，心臟
rAAV2/7	肌肉，肝臟
rAAV2/8	神經(jīng)系統(tǒng)，肝臟，胰腺，視網(wǎng)膜，脂肪組織
rAAV2/9	神經(jīng)系統(tǒng)，心。，視網(wǎng)膜，皮膚，肌肉，脂肪組織
rAAV2-retro	神經(jīng)系統(tǒng)（逆向非跨突觸）
AAV-PHP.eB	跨血腦屏障（靜脈注射）
AAV-PHP.S	全外周神經(jīng)（尾靜脈注射）
AAV-PAN	胰腺（腹腔注射）
AAV-LUNG	肺（尾靜脈注射）
AAV-DJ	視網(wǎng)膜，肺，腎臟，體外感染細(xì)胞
AAV-7m8	視網(wǎng)膜
AAV-ShH10Y	視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞
AAV-Rh10	肝臟，血液，心臟，體外感染細(xì)胞
AAV-Anc80L65	內(nèi)耳、視網(wǎng)膜、骨骼肌、肝臟
AAV-SCH9	SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞

　　小建議：如您不確定選擇哪種血清型，可嘗試使用九游會(huì)j9生物Pandora’s Virus （AAV試用裝）進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)比較不同血清型對(duì)目標(biāo)組織的感染效果，摸索最佳實(shí)驗(yàn)條件（注射方法、注射位點(diǎn)、病毒用量等），以便得到更理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（鏈接到Pandora’s Virus＞＞）

肝臟

　　肝臟是調(diào)控機(jī)體脂質(zhì)代謝、血糖代謝的重要器官，其功能異常會(huì)導(dǎo)致脂肪肝、高膽固醇血癥、高血脂癥、糖尿病等疾病。

　　1、注射方式

　　應(yīng)用病毒載體感染肝臟一般采用尾靜脈注射的方式。

　　按照九游會(huì)j9生物多年的經(jīng)驗(yàn)，使用AAV載體感染肝臟組織一般選取AAV2/8血清型，通過(guò)尾靜脈注射手段感染肝臟每只小鼠需要注射1x10¹⁰總滴度的病毒載體。

　　九游會(huì)j9生物AAV感染結(jié)果

　　2、應(yīng)用案例

　　2.1 肝臟特異啟動(dòng)子TBG

　　客戶發(fā)表文章：FASEB Journal. (IF=5.391). Yang Y,et.al. (2018). Long-term exercise prevents hepatic steatosis: a novel role of FABP1 in regulation of autophagy-lysosomal machinery. [非酒精性脂肪肝，自噬溶酶體，腺相關(guān)病毒過(guò)表達(dá)]

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　　注射方式：小鼠尾靜脈注射

　　載體：AAV8-TBG-Fabp1

　　血清型：rAAV2/8

　　注射量：200ul，2× 10¹¹ VG

　　觀察時(shí)間：1周

　　2.2 Cre-loxp技術(shù)在小鼠肝臟中的應(yīng)用

　　由于腺病毒高度嗜肝，幾乎90%以上會(huì)感染肝臟，因此腺病毒可以作為肝臟特異性感染的有效載體。將Cre腺病毒（Ad-Cre）通過(guò)尾靜脈注射入帶有l(wèi)oxp小鼠體內(nèi)，即可實(shí)現(xiàn)肝臟特異性表達(dá)并將目的基因敲除，從而快速獲取肝臟特異性基因敲除小鼠。

　　2.3 CRISPR/Cas9技術(shù)在小鼠肝臟中的應(yīng)用

　　通過(guò)腺病毒將CRISPR/Cas9系統(tǒng)相關(guān)元件（Cas9和sgRNA）注射入小鼠體內(nèi)，可以實(shí)現(xiàn)在肝臟中特異性表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)肝臟部位的特異性敲除。此方法比較適合檢驗(yàn)活體實(shí)驗(yàn)。

胰腺

　　胰腺是一個(gè)兼有內(nèi)、外分泌功能的器官，與機(jī)體消化、血糖代謝、脂質(zhì)代謝等有密切的關(guān)系，也是代謝研究的關(guān)鍵目標(biāo)器官之一。

　　在實(shí)際研究中，使用病毒載體感染胰腺主要有兩種方式，一種是使用AAV2/8病毒載體，通過(guò)膽管將病毒注射入胰腺；另一種新方法是使用九游會(huì)j9生物新研發(fā)的AAV-PAN病毒載體，腹腔注射感染胰腺：

九游會(huì)j9生物AAV-PAN感染結(jié)果

心臟

　　1、注射方式

　　AAV的注射方式，不同的文章中采用了不一樣的注射方式?？傮w上，一般包括靜脈注射、心腔內(nèi)注射、心肌內(nèi)定點(diǎn)注射、心包內(nèi)注射（介于心肌與心包膜之間），其中靜脈注射包括尾靜脈注射、頸靜脈注射、面部靜脈注射等。

　　尾靜脈注射和心腔內(nèi)注射由于病毒流進(jìn)血液循環(huán)，分布較均勻。心腔內(nèi)注射需要結(jié)合主動(dòng)脈嵌夾進(jìn)行，由于開(kāi)胸腔手術(shù)需要輔助呼吸，對(duì)手術(shù)操作要求較高。心肌內(nèi)定點(diǎn)注射時(shí)每點(diǎn)注射2-5ul，效果是在注射的局部點(diǎn)附近表達(dá)較高，但擴(kuò)散非常有限。總的來(lái)說(shuō)，很多實(shí)驗(yàn)直接用尾靜脈注射即可，但是可能需要較高劑量的病毒，如果用心肌內(nèi)定點(diǎn)注射，即小量多點(diǎn)注射，可以達(dá)到很好的感染表達(dá)效果，但是后者操作技術(shù)難度略高，也需要花費(fèi)更長(zhǎng)的操作時(shí)間。

　　結(jié)合新生鼠（出生2-10天）注射效果比較來(lái)看，新生鼠注射表達(dá)效果大大優(yōu)于成年鼠，消耗病毒劑量也相對(duì)較低。新生鼠的注射，一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的條件來(lái)看，可以選擇頸靜脈注射、面部靜脈注射和心腔內(nèi)（左心室）注射，目的是將病毒導(dǎo)入血液循環(huán)中。

　　2、啟動(dòng)子選擇

　　一些常用啟動(dòng)子如CMV、CAG、αMHC、cTnC等常被用于驅(qū)動(dòng)在心臟組織中的表達(dá)。很多高效的啟動(dòng)子由于片段較大，如αMHC，僅用于轉(zhuǎn)基因小鼠等實(shí)驗(yàn)，不適合裝載在AAV載體上。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，九游會(huì)j9發(fā)現(xiàn)一些小的啟動(dòng)子如CMV在心臟組織的表達(dá)能力比較強(qiáng)，特別對(duì)于大片段的驅(qū)動(dòng)效果很明顯，但是如果需要介導(dǎo)的目的基因在心臟中特異性表達(dá)，則推薦使用cTnT啟動(dòng)子，cTnT常被用于心肌的特異性表達(dá)，表達(dá)能力也很強(qiáng)。

　　3、應(yīng)用案例

　　3.1 心臟特異性啟動(dòng)子cTNT

　　客戶發(fā)表文章：Yue Z, et al., (2019) PDGFR-b Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Rep.

　　注射方式：

　　載體：AAV9

　　血清型：rAAV2/9

　　啟動(dòng)子：cTnT

　　注射量：200ul，2× 10^{11^VG}

　　觀察時(shí)間：1周

　　3.2 Cas9心臟特異性轉(zhuǎn)基因小鼠

　　科學(xué)家構(gòu)建了帶有eSpCas9（1.1）的心臟特異性轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)Myh6基因的啟動(dòng)子（αMHC）驅(qū)動(dòng)Cas9在心肌的特異性表達(dá)。αMHC啟動(dòng)子是心臟特異性轉(zhuǎn)基因小鼠常用啟動(dòng)子。這個(gè)工具小鼠能夠解決實(shí)驗(yàn)過(guò)程中Cas9在心臟遞送和表達(dá)的難題。轉(zhuǎn)基因小鼠可以維持Cas9在心臟長(zhǎng)期高水平的表達(dá)，而這個(gè)正是CRISPR/Cas9系統(tǒng)在心臟部位編輯效率不高的癥結(jié)所在。

　　Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠，只需要通過(guò)AAV遞送sgRNA到心臟表達(dá)即可實(shí)現(xiàn)，這種方法可以獲得比較高的編輯效率。研究人員將靶向Myh6基因外顯子sgRNA通過(guò)裝載在AAV載體上注射入小鼠，實(shí)現(xiàn)心臟特異性敲除。Myh6表達(dá)水平降低50%以上，同時(shí)成功得到發(fā)生心肌肥厚和擴(kuò)張型心臟的突變小鼠。

肺部

　　目前對(duì)于肺部的病毒感染，普遍采用AAV病毒載體，使用病毒載體感染胰腺主要有兩種方式，一種是使用AAV2/9病毒載體，通過(guò)鼻內(nèi)或氣管內(nèi)遞送（經(jīng)呼吸道）將病毒通過(guò)肺呼吸道遞送，參考劑量是1×10¹¹VG病毒，體積50ul；另一種新方法是使用九游會(huì)j9生物新研發(fā)的AAV-LUNG病毒載體，尾靜脈注射特異性感染肺部：

　　九游會(huì)j9AAV-LUNG感染肺部結(jié)果

肌肉

　　目前，對(duì)于肌肉組織中使用的病毒載體通常會(huì)選用AAV病毒載體，因?yàn)锳AV不僅能夠高效特異地靶向肌肉組織，且能在肌肉組織中表達(dá)持久。腺病毒使用時(shí)容易引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，并且很容易被清除，表達(dá)時(shí)間比較短暫，較少被應(yīng)用于肌肉組織的靶向表達(dá)。盡管慢病毒感染表達(dá)范圍廣泛，對(duì)培養(yǎng)的肌肉細(xì)胞均能高效表達(dá)，但是對(duì)肌肉組織的感染表達(dá)非常有限。目前靶向肌肉的AAV載體血清型主要為AAV1，AAV6和AAV9。其中，AAV9的表達(dá)效率最高，并且更容易在肌肉中高表達(dá)。

　　1、注射方式

　　應(yīng)用病毒載體感染肌肉組織進(jìn)行研究，一般分為系統(tǒng)注射和肌肉內(nèi)注射，系統(tǒng)注射表達(dá)較均勻，但是大部分病毒會(huì)被其他臟器組織吸收，導(dǎo)致靶向肌肉的病毒較少。肌肉內(nèi)注射是一種定點(diǎn)注射，可以在注射點(diǎn)附近高效表達(dá)，但缺點(diǎn)是病毒擴(kuò)散十分有限，因此往往需要多點(diǎn)注射，一般每個(gè)點(diǎn)在5-10ul。

　　2、應(yīng)用案例