內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄激活/抑制

　　通過人為突變Cas9的RuvC1、HNH兩個剪切位點，Cas9蛋白的切割能力損失變成dCas9蛋白，dCas9和sgRNA復(fù)合物可以在DNA的特定位置結(jié)合在DNA上，在此基礎(chǔ)上，研究人員在復(fù)合物的后方連接一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如轉(zhuǎn)錄激活的VP64、VP16等，轉(zhuǎn)錄抑制的KRAB等，同時將復(fù)合物錨定在基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域的上游，即可實現(xiàn)對特定基因的轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制。

優(yōu)勢

　、常規(guī)基因過表達都是將外源基因轉(zhuǎn)入，外源基因的兼容性必然低于內(nèi)源基因。

　、對于一些涉及多次跨膜的蛋白，外源轉(zhuǎn)入的基因常表達功能不完整的蛋白，導(dǎo)致過表達無效，而對內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄激活無需擔(dān)心此問題。

　、由于容量問題，很多大的基因片段難以構(gòu)建進載體，而基于dCas9蛋白的轉(zhuǎn)錄激活識別的是轉(zhuǎn)錄起始點，對于基因大小無要求，因此可用于研究大基因片段的過表達。

載體選擇（部分）

可以對特定基因進行內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄激活或抑制。

載體類別	編號	載體元件
CRISPRa（轉(zhuǎn)錄激活）慢病毒載體	H7284	pCLenti-U6-gRNA-2x(wt+f6)MS2-CMV-MCP-P65-HSF1-IRES-BSR-WPRE
	H7281	pLenti-CMV-dCas9-VP64-T2A-Puro-WPRE
	H9517	pCLenti-U6-gRNA-MS2-EFS-dCas9-VP64-T2A-BSD-WPRE
	E2577	pCLenti-EF1a-MCP-P65-HSF1-T2A-Hygro-WPRE
CRISPRa（轉(zhuǎn)錄抑制）慢病毒載體	H6929	pCLenti-U6-gRNA-2x(wt+f6)MS2-CMV-NLS-MCP-KRAB-IRES-BSR-WPRE
CRISPRa（轉(zhuǎn)錄抑制）慢病毒載體	H7283	pLenti-CMV-dCas9-KRAB-T2A-Puro-WPRE