• 基因組DNA
• 文庫(kù)構(gòu)建
• 外顯子&目標(biāo)區(qū)域富集
• 上機(jī)測(cè)序（HiSeq 4000，PE150）
• 數(shù)據(jù)分析

1.與基因組比對(duì)（覆蓋度、測(cè)序深度）
樣品比對(duì)率是指比對(duì)到參考基因組上的數(shù)據(jù)量占有效測(cè)序數(shù)據(jù)量的比值，反映樣本與參考基因組的相似性。測(cè)序深度是指比對(duì)到參考基因組的堿基總數(shù)占基因組的比值；覆蓋度是指被測(cè)到的該物種基因組堿基總數(shù)占該物種基因組長(zhǎng)度的百分比。

2.SNP分析
SNP全稱Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異，形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。基因組上單 個(gè)核苷酸的變異包括置換，缺失和插入。采用FreeBayes對(duì)各樣品比對(duì) 結(jié)果進(jìn)行個(gè)體SNP的檢測(cè)。

 

3.InDel分析
InDel (Insertion-Deletion) 是指相對(duì)于參考基因組，樣本中發(fā)生的小片段的插入缺失，該插入缺失可能含一個(gè)或多個(gè)堿基。根據(jù)InDel在基因組中的位置，可以分為編碼區(qū)序列的InDel和非編碼區(qū)序列的InDel。編碼序列中的InDel發(fā)生與編碼蛋白質(zhì)的功能和氨基酸位點(diǎn)在結(jié)構(gòu)和功能上的重要性有關(guān)。采用FreeBayes對(duì)各樣品比對(duì)結(jié)果進(jìn)行個(gè)體InDel的檢測(cè)。
 

1.什么是copy number variation （CNV）基因組拷貝數(shù)變異？
基因組拷貝數(shù)變異是基因組變異的一種形式，通常使基因組中大片段的DNA形成非正常的拷貝數(shù)量。例如人類正常染色體拷貝數(shù)是2，有些染色體區(qū)域拷貝數(shù)變成1或3，這樣，該區(qū)域發(fā)生拷貝數(shù)缺失或增加，位于該區(qū)域內(nèi)的基因表達(dá)量也會(huì)受到影響。如果把一條染色體分成A-B-C-D四個(gè)區(qū)域，則A-B-C-C-D/A-C-B-C-D/A-C-C-B-C-D/A-B-D分別發(fā)生了C區(qū)域的擴(kuò)增及缺失，擴(kuò)增的位置可以是連續(xù)擴(kuò)增如A-B-C-C-D也可以是在其他位置的擴(kuò)增，如A-C-B-C-D。

2.癌組織為什么要采用高深度測(cè)序？
相對(duì)于遺傳病而言，腫瘤組織樣品中突變位點(diǎn)的等位基因頻率較低，一方面由于腫瘤細(xì)胞在腫瘤組織中的占比偏低，另一方面則由于癌癥發(fā)展后期產(chǎn)生的突變僅存在于極少量的腫瘤細(xì)胞中，采用高深度測(cè)序可以盡可能全面的檢測(cè)到與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的變異。通常推薦的外顯子測(cè)序深度為，癌組織大于150x，癌旁組織/血液大于50x。

3.人外顯子測(cè)序一般推薦多少測(cè)序深度？
建議有效測(cè)序深度在100x以上。有文獻(xiàn)顯示外顯子組測(cè)序深度會(huì)影響變異檢出率，隨著測(cè)序深度的升高，變異檢出率增大，且達(dá)到一定深度時(shí)，變異檢出達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)。