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生理操作

成像技術(shù)

　　一、鈣離子成像技術(shù)（Calcium imaging）　　

　　鈣離子成像技術(shù)（Calcium imaging）是指利用鈣離子指示劑監(jiān)測組織內(nèi)鈣離子濃度的方法。在神經(jīng)系統(tǒng)研究中，九游會j9常用鈣離子成像技術(shù)監(jiān)測神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化，提示神經(jīng)元活動。有了鈣成像技術(shù)，原本悄無聲息的電生理活動就變成了一幅形象地、斑斕閃爍的壯觀影像，研究人員可以同時大量追蹤神經(jīng)元活動，研究其關(guān)系，因而被全世界神經(jīng)科學(xué)家們追捧。

　　圖1.鈣離子成像技術(shù)　　

　　1）鈣離子成像技術(shù)原理　　

　　在生物體內(nèi)，鈣離子是細(xì)胞信號產(chǎn)生的基。諍芏喙δ芊矯嬗兄匾饔謾Ｔ誆溉槎锏納窬低持，鈣離子是一類重要的神經(jīng)元胞內(nèi)信號分子，神經(jīng)元靜息狀態(tài)下，胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而當(dāng)神經(jīng)元活動的時候，胞內(nèi)鈣離子濃度能上升10-100倍，而鈣離子對于突觸囊泡釋放必不可少；神經(jīng)元在放電的時候會爆發(fā)出一個短暫的鈣離子濃度高峰，這意味著神經(jīng)元鈣離子濃度表征突觸傳遞和神經(jīng)元活動。　　

　　圖2 神經(jīng)元鈣離子濃度表征突觸傳遞和神經(jīng)元活動示意圖　　

　　因而，神經(jīng)元鈣離子成像技術(shù)的原理就是借助鈣離子濃度與神經(jīng)元活動之間的嚴(yán)格對應(yīng)關(guān)系，利用特殊的熒光染料或者蛋白質(zhì)熒光探針（鈣離子指示劑，Calcium indicator），將神經(jīng)元中鈣離子的濃度通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來，并被顯微鏡捕捉，從而達(dá)到監(jiān)測
神經(jīng)元活動的目的（圖3）?！　?/div>

　　因而，鈣離子成像技術(shù)的核心在于鈣離子指示劑，現(xiàn)在廣泛使用的鈣離子指示劑有化學(xué)性鈣離子指示劑（chemical indicators）和基因編碼鈣離子指示劑（genetically-encoded indicators）兩類：

　　1、化學(xué)性鈣離子指示劑：指的是可以螯合鈣離子的小分子，所有這些小分子都基于BAPTA（氨基苯乙烷四乙酸），BAPTA能夠特異性地和鈣離子螯合，而不會和鎂離子螯合，所以被廣泛地用作鈣離子螯合劑。目前較為成熟的化學(xué)性鈣離子指示劑包括Oregon Green-1、Fura-2、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4?！　?/div>

　　2、基因編碼鈣離子指示劑：這些指示劑是來自于綠色熒光蛋白（GFP）及其變異體（例如循環(huán)排列GFP、YFP、CFP）的熒光蛋白質(zhì)，與鈣調(diào)蛋白（CaM）和肌球蛋白輕鏈激酶M13域融合。現(xiàn)在使用較廣泛的基因編碼鈣離子指示劑有：GCaMP、Pericams、Cameleons、TN-XXL和Twitch，其中GCaMP6由于它有著超強(qiáng)的敏感度，現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于活體鈣成像研究，其發(fā)出熒光的原理在于鈣離子濃度上升導(dǎo)致M13與CaM結(jié)合，從而改變cpEGFP的構(gòu)象，將其從無熒光的狀態(tài)變?yōu)榫G色熒光

　　圖3 GCaMP蛋白的基本結(jié)構(gòu)和原理（來自WIKI）　　

　　2）常見的鈣離子指示劑　　

　　1、GCaMP6系列：　　

　　第六代GCaMP蛋白（GCaMP6）有三種不同亞型：GCaMP6s、GCaMP6m、GCaMP6f，其特點(diǎn)各不相同（圖4）。GCaMP6s高敏感，適合低頻信號的指示，；GCaMP6f有快速動力學(xué)曲線，解離最快，適合高頻信號的指示，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。

圖4 幾種不同GCaMP蛋白的特性（Douglas S. Kim, et al., Nature, 2013）　　

　　2、jGCaMP7家族：　　

　　jGCaMP7（Janelia GCaMP7，區(qū)別于過去出現(xiàn)過的G-CaMP7）。包括四類不同特點(diǎn)的蛋白：jGCaMP7s、jGCaMP7f、jGCaMP7b、jGCaMP7c（圖5）。jGCaMP7s高敏感；jGCaMP7f具有快速動力學(xué)曲線，適用于更強(qiáng)的檢測單動作電位反應(yīng)或群里活動實(shí)驗(yàn)；jGCaMP7b具有較明亮的背景熒光，適用檢測神經(jīng)元突起或神經(jīng)纖維；jGCaMP7c的本底熒光最低，對比度高，信號清晰，適用于大范圍成像?！　?/div>

圖5 jGCaMP7蛋白的反應(yīng)特點(diǎn)（Douglas S. Kim, et al., bioRXiv, 2018）　　

　　3、XCaMP系列：　　

　　基于CaMKK為骨架，通過一系列的突變篩。ㄋ鬧植煌丈：藍(lán)色的XCaMP-B，綠色的XCaMP-G，橙色的XCaMP-O和紅色的XCaMP-R（圖6）。其中XCaMP-G的熒光強(qiáng)度比GCaMP6強(qiáng)，動作電位刺激誘發(fā)的鈣離子反應(yīng)性能也比GCaMP6有明顯提高。結(jié)合特定的神經(jīng)元特異的表達(dá)方法，可實(shí)現(xiàn)在自由活動狀態(tài)下同時監(jiān)測特定行為中三種不同神經(jīng)元類型的活動；結(jié)合雙光子顯微鏡，進(jìn)行微結(jié)構(gòu)功能成像，實(shí)現(xiàn)對突觸前和突觸后結(jié)構(gòu)同時雙色成像。

　　圖6 XCaMP蛋白特點(diǎn)（Haruhiko Bito’s, lab.,cell, 2019）　　

　　4、CaMPARI：　　

　　一種能夠兼顧全局和微觀的新型鈣成像技術(shù)，包含CaMPARI以及CaMPARI2（第二代）。其原理在于，CaMPARI蛋白在正常狀態(tài)下會發(fā)出綠色熒光，而如果對這種蛋白同時使用高濃度鈣離子與紫外光處理，它就會不可逆、永久地轉(zhuǎn)變成另一種能發(fā)出紅色熒光的構(gòu)象，即實(shí)現(xiàn)將瞬間的神經(jīng)元活動變成永久的紅色熒光蛋白表達(dá)（圖7）。研究人員通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將這種新型蛋白導(dǎo)入到實(shí)驗(yàn)動物的神經(jīng)系統(tǒng)中，然后用高強(qiáng)度的紫外光照射動物的大腦，通過檢查熒光，找到發(fā)紅色熒光的神經(jīng)元，這些神經(jīng)元即是在紫外光照射期間活躍的神經(jīng)元。由于紫外光可以對著整個大腦進(jìn)行照射，所以理論上，人們可以對全腦進(jìn)行檢查。

　　圖7 CaMPARI技術(shù)原理（Eric R. Schreiter, et al., Science, 2015）　　

　　5、jRGECO1a&RCaMP：　　

　　紅色的鈣離子敏感蛋白，可以同GCaMP一起使用，標(biāo)記同一小鼠同一腦區(qū)兩類細(xì)胞的活動不同的神經(jīng)元類型?！　?/div>

　　6、GCaMP-X：　　

　　無損傷鈣離子探針，可保護(hù)依賴于L型鈣通道的興奮-轉(zhuǎn)錄耦合免受干擾，同時仍表現(xiàn)出部分GCaMP的優(yōu)良Ca2+感應(yīng)特性。　　

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　　二、電壓成像（voltage imaging）　　

　　細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化和細(xì)胞膜電位的變化是細(xì)胞活動的兩個重要指標(biāo)，由于鈣信號衰減較慢，并不能充分表征神經(jīng)元的動作電位，而且閾值以下的電壓信號完全被忽略，于是科學(xué)家們利用細(xì)胞膜電位改變作為信號進(jìn)行熒光成像。

　　1)電壓成像技術(shù)原理　　

　　細(xì)胞膜電位變化是細(xì)胞活動最基本的信號，當(dāng)膜電位變化時，細(xì)胞膜上鑲嵌的許多蛋白質(zhì)分子都會改變形狀，這類隨膜電位改變形狀的蛋白分子叫電壓敏感元件。而電壓成像技術(shù)原理就在于將電壓敏感元件和熒光蛋白連接起來，當(dāng)膜電位改變時，電壓敏感蛋白的改變就會影響熒光蛋白的結(jié)構(gòu)，從而改變了后者的發(fā)光特性。這樣就可以利用熒光來看神經(jīng)細(xì)胞膜的膜電位變化了?！　?/div>

　　遺傳編碼的熒光電壓指示劑（Genetically encoded voltage indicators, GEVIs）改造于一種細(xì)菌能吸收陽光的蛋白質(zhì)--古紫質(zhì)Archaerhodopsin，其能隨著細(xì)胞膜電位改變發(fā)出熒光。通過GEVIs九游會j9可以成像神經(jīng)元的快速放電信號與閾下電活動，能實(shí)時監(jiān)測細(xì)胞膜電位的波動，相比于鈣指標(biāo)，更能直接反映神經(jīng)元的活性。

　　圖8 三種類型GEVIs的示意圖（Storace, D., et al., Trends Neurosci, 2016）　　

　　Voltron，是一種新型電壓指示劑，不同于傳統(tǒng)的GEVIs依賴于微生物視紫紅質(zhì)或熒光蛋白（這些熒光基團(tuán)缺乏亮度與光穩(wěn)定性），Voltron利用明亮且耐光型的合成染料。其原理在于Voltron將電壓敏感性微生物視紫紅質(zhì)結(jié)構(gòu)域和自標(biāo)記蛋白標(biāo)記域結(jié)合染料結(jié)合，后者可共價結(jié)合一種人工熒光染料配體，合成染料給藥方式簡單，且可跨血腦屏障。體內(nèi)同時成像神經(jīng)元的數(shù)量擴(kuò)大10倍，且成像時間更加持久。

　　圖9 Voltron結(jié)構(gòu)的示意圖（Eric R. Schreiter’s lab., science, 2019）　　

　　神經(jīng)元功能成像是探究神經(jīng)元編碼各種功能的重要科學(xué)手段，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)等各個研究領(lǐng)域，目前最常用方法為鈣成像和電壓成像。得益于雙光子成像技術(shù)，通過記錄細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化或細(xì)胞電位變化，實(shí)時反應(yīng)細(xì)胞活動，實(shí)現(xiàn)了一系列行為動物活體動態(tài)功能成像技術(shù)！　　

　　三、神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針　　

　　在已知宇宙中，腦可能是最復(fù)雜的物體之一。根據(jù)前人的估計，九游會j9的腦大約有1010-1012個神經(jīng)元和1011-1013個膠質(zhì)細(xì)胞，同時每個神經(jīng)元擁有103-104個突觸與其他神經(jīng)元形成聯(lián)系。神經(jīng)遞質(zhì)作為突觸間傳遞信息的重要“信使”，在神經(jīng)元與細(xì)胞之間的通訊交流中起到關(guān)鍵的媒介作用，神經(jīng)遞質(zhì)的紊亂常常伴隨各種疾病的發(fā)生。因此,對神經(jīng)遞質(zhì)的探測追蹤是研究大腦功能和相關(guān)疾病的重要環(huán)節(jié)。然而，如何在擁有數(shù)十億個神經(jīng)細(xì)胞、數(shù)萬億個突觸連接的大腦中精確檢測神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，是長久以來困擾科學(xué)家的一個難題?！　?/div>

　　北京大學(xué)李毓龍團(tuán)隊利用可與神經(jīng)遞質(zhì)相結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受體作為探針的骨架，將熒光蛋白（cpEGFP）與特異性的人源神經(jīng)遞質(zhì)受體巧妙地進(jìn)行分子水平的融合和改造，成功開發(fā)出新型可遺傳編碼的一系列神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針?！　?/div>

　　1）神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針原理　　

　　這一系列神經(jīng)遞質(zhì)探針原理類似，都是基于人源神經(jīng)遞質(zhì)受體，其原理在于把cpEGFP嵌入特定的神經(jīng)遞質(zhì)受體，受體與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合后會引發(fā)受體構(gòu)象改變轉(zhuǎn)換為熒光信號（圖10）?！　?/div>

　　目前通過病毒注射、轉(zhuǎn)染等技術(shù)手段，可以將這種可遺傳編碼的探針表達(dá)在細(xì)胞或小鼠腦部，借助成像技術(shù)，觀察神經(jīng)遞質(zhì)濃度的實(shí)時變化。這類神經(jīng)調(diào)質(zhì)探針具有極高的靈敏度、分子特異性、精確的空間分辨率和亞秒級響應(yīng)速度，已在果蠅、斑馬魚。小鼠腦部十幾種神經(jīng)元上得到驗(yàn)證，這將為研究大腦的功能以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)制的解析提供重要的工具。

　　圖10 GACh原理（Yulong Li’s lab., Nat Biotechnol, 2018）

　　2)常見的神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針　　

　　1、DA　　

　　多巴胺是大腦中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，調(diào)控包括學(xué)習(xí)、記憶、運(yùn)動等一系列關(guān)鍵功能，多巴胺失調(diào)會導(dǎo)致精神疾病或神經(jīng)退行性疾。喟桶誹秸氚：DA1h和DA1m兩種版本，分別對應(yīng)高/低親和力，適用于多巴胺釋放量不同的腦區(qū)（圖11）。

　　圖11 GRABDA sensors表達(dá)在細(xì)胞和神經(jīng)元中（Yulong Li’s lab., cell, 2018）　　

　　2、Ach　　

　　乙酰膽堿是人類發(fā)現(xiàn)的第一種神經(jīng)遞質(zhì)，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)睡眠、成癮、學(xué)習(xí)記憶等過程。乙酰膽堿信號傳遞失常，會導(dǎo)致先天性肌肉萎縮、糖尿病、阿茲海默癥等疾病。GACh2.0對生理濃度乙酰膽堿具有高信噪比、高靈敏性的光學(xué)信號變化響應(yīng)，并且具有亞秒級動力學(xué)及高度分子特異性，可實(shí)現(xiàn)對時空特異性乙酰膽堿信號的精確指征（圖12）。

　　圖12 GACh2.0 sensors特性（Yulong Li’s lab., Nat Biotechnol, 2018）　　

　　3、NE　　

　　去甲腎上腺素作為一種重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，參與感覺信號的調(diào)節(jié)、注意力調(diào)控、睡眠于覺醒、學(xué)習(xí)記憶等生理過程，去甲腎上腺素釋放或信號傳遞的受損與一系列的精神疾病和神經(jīng)退行性病變息息相關(guān)。去甲腎上腺素探針包含：NE1m和NE1h兩種版本，分別對應(yīng)高/低親和力，適用于檢測局部突觸傳遞和非局部非突觸傳遞的去甲腎上腺素釋放（圖13）。

　　圖13 GRABNE sensors表達(dá)神經(jīng)元（Yulong Li’s lab., Neuron, 2019）

　　此外，李毓龍教授團(tuán)隊正在積極開發(fā)更多新的神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽等熒光探針?！　?/div>

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　　成像技術(shù)應(yīng)用案例　　

　　1、GCaMP6f　　

　　客戶發(fā)表文章：Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相關(guān)病毒, 覺醒]

　　注射部位：小鼠PVT　　

　　載體：AAV-CaMKIIα-GCaMP6f　　

　　注射體積：100nl　　

　　觀察時間：4周　　

　　2、GCaMP6s　　

　、客戶發(fā)表文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相關(guān)病毒, 癢, 光遺傳, 化學(xué)遺傳，鈣成像]

　　注射部位：小鼠PBN　　

　　載體：AAV-hSyn-GCaMP6s　　

　　血清型：rAAV2/9　　

　　病毒滴度：5.3x1012 VG/mL　　

　　注射體積：300nl　　

　　觀察時間：3周　　

　?、?客戶發(fā)表文章：Nature Neuroscience. (IF=19.912). Yao J,et.al. (2018). A corticopontine circuit for initiation of urination. [腺相關(guān)病毒, 神經(jīng)環(huán)路]