基因操作

基因過表達(dá)

　　基因功能研究中通常需要上調(diào)目的基因的表達(dá)來觀察表型的變化。過表達(dá)是將目的基因在宿主細(xì)胞大量表達(dá)的過程，其基本原理是將目的基因構(gòu)建到工具載體上，導(dǎo)入細(xì)胞使基因?qū)崿F(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的過表達(dá)。工具載體通常包括原核表達(dá)載體、普通真核表達(dá)載體、慢病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。

工具載體介紹

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要不同，目的基因大小等選擇不同的載體，包括真核表達(dá)載體和病毒載體等均可以實(shí)現(xiàn)編碼基因和非編碼基因的過表達(dá)。

表達(dá)系統(tǒng)	真核表達(dá)載體	慢病毒載體	重組腺相關(guān)病毒載體	重組腺病毒載體
載體基因特性	雙鏈DNA質(zhì)粒	RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒	單鏈DNA病毒	雙鏈DNA病毒
外源基因表達(dá)時間	24h開始表達(dá)，持續(xù)3-7天	2-4天開始表達(dá)，長時間穩(wěn)定表達(dá)	7-14天開始表達(dá)	1-2天開始表達(dá)
插入片段大小	8kb左右	4kb左右	2.8kb左右	6kb左右
穩(wěn)定細(xì)胞株篩選	難操作	可以	不可以	不可以，瞬時表達(dá)
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)	細(xì)胞系，部分轉(zhuǎn)染效率低	首。閆，感染效率高	不適合	廣譜，感染效率高
動物實(shí)驗(yàn)	不適合	適合，根據(jù)觀察時間和注射部位	首。莨鄄焓奔浜妥⑸洳課	免疫原性高，慎選
滴度范圍	無	10⁸~10⁹TU/ml	10¹²-10¹³vg/ml	10¹⁰-10¹¹pfu/ml

載體圖譜中常見元件介紹

元件名稱	類型	用途
啟動子	CMV、CAG、EF1a、U6等	廣譜或特異啟動目的基因的表達(dá)
啟動子	hSyn、CaMKIIα等	特異性啟動子，在特定的組織細(xì)胞中啟動目的基因的表達(dá)
蛋白標(biāo)簽	3xFLAG、HA 、6xHis、Myc等	與目的基因融合表達(dá)，常用于檢測外源蛋白表達(dá)水平
熒光標(biāo)記	EGFP、mCherry、mNeonGreen等	可與目的基因融合或非融合表達(dá)用于檢測轉(zhuǎn)染、感染效果
抗性基因	Puro、Neo、Hygro、BSD等	真核抗性，常用于穩(wěn)定株篩選
抗性基因	Amp、Kan	原核抗性，常用于原核細(xì)菌培養(yǎng)，質(zhì)粒擴(kuò)增
連接元件	Linker	用于連接兩個基因，融合表達(dá)時常用，可降低因融合表達(dá)對蛋白折疊和功能的影響
連接元件	IRES、2A	用于連接兩個基因，達(dá)到非融合表達(dá)的效果
其它元件	WPRE	增加目的基因的表達(dá)

載體選擇（部分）

病毒載體的選擇，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求參考慢病毒、腺相關(guān)病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。

載體類別	編號	載體元件
慢病毒過表達(dá)	GL127	pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE
	GL121	pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPRE
	GL107	pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE
	GL122	pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPRE
	GL124	pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE
腺病毒過表達(dá)	H225	pADV-mCMV-MCS-3xFLAG
	H201	pADV-mCMV-EGFP-3xFLAG
	H213	pADV-mCMV-3xFLAG-EGFP
	H204	pADV-mCMV-mCherry-HA
腺相關(guān)病毒過表達(dá)	AOV024	pAAV-CMV-EGFP-P2A-3xFLAG-WPRE
	AOV025	pAAV-CMV-mCherry-P2A-3xFLAG-WPRE
	AOV064	pAAV-hSyn-EGFP-P2A-3xFLAG-WPRE
	AOV065	AAV-hSyn-mCherry-P2A-3xFLAG-WPRE
	H9429	pAAV-CAG-EGFP-3xFLAG-tWPA
	H9525	pAAV-CMV-EGFP-3xFLAG-tWPA
	H10881	pAAV-CAG-EGFP-3xFLAG-tWPA
	H10886	pAAV-CMV-EGFP-3xFLAG-tWPA

服務(wù)簡介

根據(jù)客戶提供的基因信息，從生物信息學(xué)網(wǎng)站上調(diào)出該基因的cDNA序列，將cDNA序列構(gòu)建到工具載體中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求過表達(dá)編碼基因或者非編碼基因。針對病毒載體，包裝生產(chǎn)的病毒顆?？梢灾苯佑糜诟腥炯?xì)胞或者動物實(shí)驗(yàn)。

病毒載體服務(wù)流程