基因操作

基因過表達(dá)

　　基因功能研究中通常需要上調(diào)目的基因的表達(dá)來觀察表型的變化。過表達(dá)是將目的基因在宿主細(xì)胞大量表達(dá)的過程，其基本原理是將目的基因構(gòu)建到工具載體上，導(dǎo)入細(xì)胞使基因?qū)崿F(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的過表達(dá)。工具載體通常包括原核表達(dá)載體、普通真核表達(dá)載體、慢病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。

工具載體介紹

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要不同，目的基因大小等選擇不同的載體，包括真核表達(dá)載體和病毒載體等均可以實(shí)現(xiàn)編碼基因和非編碼基因的過表達(dá)。

表達(dá)系統(tǒng)	真核表達(dá)載體	慢病毒載體	重組腺相關(guān)病毒載體	重組腺病毒載體
載體基因特性	雙鏈DNA質(zhì)粒	RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒	單鏈DNA病毒	雙鏈DNA病毒
外源基因表達(dá)時(shí)間	24h開始表達(dá)，持續(xù)3-7天	2-4天開始表達(dá)，長時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)	7-14天開始表達(dá)	1-2天開始表達(dá)
插入片段大小	8kb左右	4kb左右	2.8kb左右	6kb左右
穩(wěn)定細(xì)胞株篩選	難操作	可以	不可以	不可以，瞬時(shí)表達(dá)
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)	細(xì)胞系，部分轉(zhuǎn)染效率低	首。閆，感染效率高	不適合	廣譜，感染效率高
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)	不適合	適合，根據(jù)觀察時(shí)間和注射部位	首。莨鄄焓奔浜妥⑸洳課	免疫原性高，慎選
滴度范圍	無	10⁸~10⁹TU/ml	10¹²-10¹³vg/ml	10¹⁰-10¹¹pfu/ml

載體圖譜中常見元件介紹

元件名稱	類型	用途
啟動(dòng)子	CMV、CAG、EF1a、U6等	廣譜或特異啟動(dòng)目的基因的表達(dá)
啟動(dòng)子	hSyn、CaMKIIα等	特異性啟動(dòng)子，在特定的組織細(xì)胞中啟動(dòng)目的基因的表達(dá)
蛋白標(biāo)簽	3xFLAG、HA 、6xHis、Myc等	與目的基因融合表達(dá)，常用于檢測(cè)外源蛋白表達(dá)水平
熒光標(biāo)記	EGFP、mCherry、mNeonGreen等	可與目的基因融合或非融合表達(dá)用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染、感染效果
抗性基因	Puro、Neo、Hygro、BSD等	真核抗性，常用于穩(wěn)定株篩選
抗性基因	Amp、Kan	原核抗性，常用于原核細(xì)菌培養(yǎng)，質(zhì)粒擴(kuò)增
連接元件	Linker	用于連接兩個(gè)基因，融合表達(dá)時(shí)常用，可降低因融合表達(dá)對(duì)蛋白折疊和功能的影響
連接元件	IRES、2A	用于連接兩個(gè)基因，達(dá)到非融合表達(dá)的效果
其它元件	WPRE	增加目的基因的表達(dá)

載體選擇（部分）

病毒載體的選擇，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求參考慢病毒、腺相關(guān)病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。

載體類別	編號(hào)	載體元件
慢病毒過表達(dá)	GL127	pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE
	GL121	pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPRE
	GL107	pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE
	GL122	pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPRE
	GL124	pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE
腺病毒過表達(dá)	H225	pADV-mCMV-MCS-3xFLAG
	H201	pADV-mCMV-EGFP-3xFLAG
	H213	pADV-mCMV-3xFLAG-EGFP
	H204	pADV-mCMV-mCherry-HA
腺相關(guān)病毒過表達(dá)	AOV024	pAAV-CMV-EGFP-P2A-3xFLAG-WPRE
	AOV025	pAAV-CMV-mCherry-P2A-3xFLAG-WPRE
	AOV064	pAAV-hSyn-EGFP-P2A-3xFLAG-WPRE
	AOV065	AAV-hSyn-mCherry-P2A-3xFLAG-WPRE
	H9429	pAAV-CAG-EGFP-3xFLAG-tWPA
	H9525	pAAV-CMV-EGFP-3xFLAG-tWPA
	H10881	pAAV-CAG-EGFP-3xFLAG-tWPA
	H10886	pAAV-CMV-EGFP-3xFLAG-tWPA

服務(wù)簡(jiǎn)介

根據(jù)客戶提供的基因信息，從生物信息學(xué)網(wǎng)站上調(diào)出該基因的cDNA序列，將cDNA序列構(gòu)建到工具載體中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求過表達(dá)編碼基因或者非編碼基因。針對(duì)病毒載體，包裝生產(chǎn)的病毒顆?？梢灾苯佑糜诟腥炯?xì)胞或者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

病毒載體服務(wù)流程