基因操作

CRISPR/Cas9

　　CRISPR/Cas9 是一種能夠?qū)蚪M的特定位點進行精確編輯的技術(shù)。其原理是核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白通過導向性RNA（guide RNA, gRNA）識別特定基因組位點并對雙鏈DNA進行切割，造成DNA雙鏈斷裂，細胞利用非同源末端連接(Non homologous End Joining，NHEJ）或者同源重組（Homologous Recombination, HR）方式對切割位點進行修復，實現(xiàn)DNA水平基因敲除或精確編輯。
　　CRISPR/Cas9 系統(tǒng)主要由兩部分組成：
　　1. 單鏈的guide RNA（single-guide RNA，sgRNA）
　　2. 有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9 蛋白

CRISPR基因敲除

　　以基因敲除為目的時，可以利用Cas9-sgRNA對DNA進行切割產(chǎn)生雙鏈斷裂，隨后細胞通過非同源末端連接方式修復DNA，在此過程中，將隨機引入堿基的缺失或增加，基因發(fā)生移碼突變，導致編碼基因的敲除?！　?/div>

CRISPR基因編輯　　

　　以基因敲入或替換為目的時，需要借助同源重組原理。CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的Cas9-sgRNA在靶位點進行切割產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，在模板DNA存在時，細胞通過同源重組方式修復DNA，而模板DNA可以被人為設(shè)計成需要插入的基因或需要修復的基因，此時細胞編碼目的基因。

載體的選擇（部分）

　　提供病毒載體的含Cas9蛋白的單載和雙載系統(tǒng)，可根據(jù)目的基因序列設(shè)計多條gRNA，載體帶有多種熒光抗性標記，方便篩選。

載體類別	編號	載體元件
CRISPR慢病毒單載體	H5070	pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE
	H7072	pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-BSR-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE
	H6825	pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE
CRISPR慢病毒雙載體	H5068	pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE
CRISPR慢病毒雙載體	H5450	pLenti-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-espCas9_1.1-WPRE
CRISPR AAV單載體系統(tǒng)	H6941	pAAV-CMV-SaCas9-U6-sagRNA v2.0
CRISPR AAV單載體系統(tǒng)	H5273	pAAV-hSyn-SaCas9-U6-sagRNA v2.0
CRISPR AAV雙載體系統(tǒng)	H6291	pAAV-CMV-EGFP-WPRE-U6-spgRNA v2.0
	H12663	pAAV-U6-shRNA/spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE
	H11012	pAAV-CMV-Luc2-WPRE-U6-spgRNA