基因操作

CRISPR/Cas9

　　CRISPR/Cas9 是一種能夠?qū)蚪M的特定位點(diǎn)進(jìn)行精確編輯的技術(shù)。其原理是核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白通過(guò)導(dǎo)向性RNA（guide RNA, gRNA）識(shí)別特定基因組位點(diǎn)并對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂，細(xì)胞利用非同源末端連接(Non homologous End Joining，NHEJ）或者同源重組（Homologous Recombination, HR）方式對(duì)切割位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)，實(shí)現(xiàn)DNA水平基因敲除或精確編輯。
　　CRISPR/Cas9 系統(tǒng)主要由兩部分組成：
　　1. 單鏈的guide RNA（single-guide RNA，sgRNA）
　　2. 有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9 蛋白

CRISPR基因敲除

　　以基因敲除為目的時(shí)，可以利用Cas9-sgRNA對(duì)DNA進(jìn)行切割產(chǎn)生雙鏈斷裂，隨后細(xì)胞通過(guò)非同源末端連接方式修復(fù)DNA，在此過(guò)程中，將隨機(jī)引入堿基的缺失或增加，基因發(fā)生移碼突變，導(dǎo)致編碼基因的敲除?！　?/div>

CRISPR基因編輯　　

　　以基因敲入或替換為目的時(shí)，需要借助同源重組原理。CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的Cas9-sgRNA在靶位點(diǎn)進(jìn)行切割產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，在模板DNA存在時(shí)，細(xì)胞通過(guò)同源重組方式修復(fù)DNA，而模板DNA可以被人為設(shè)計(jì)成需要插入的基因或需要修復(fù)的基因，此時(shí)細(xì)胞編碼目的基因。

載體的選擇（部分）

　　提供病毒載體的含Cas9蛋白的單載和雙載系統(tǒng)，可根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)多條gRNA，載體帶有多種熒光抗性標(biāo)記，方便篩選。

載體類別	編號(hào)	載體元件
CRISPR慢病毒單載體	H5070	pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE
	H7072	pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-BSR-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE
	H6825	pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE
CRISPR慢病毒雙載體	H5068	pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE
CRISPR慢病毒雙載體	H5450	pLenti-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-espCas9_1.1-WPRE
CRISPR AAV單載體系統(tǒng)	H6941	pAAV-CMV-SaCas9-U6-sagRNA v2.0
CRISPR AAV單載體系統(tǒng)	H5273	pAAV-hSyn-SaCas9-U6-sagRNA v2.0
CRISPR AAV雙載體系統(tǒng)	H6291	pAAV-CMV-EGFP-WPRE-U6-spgRNA v2.0
	H12663	pAAV-U6-shRNA/spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE
	H11012	pAAV-CMV-Luc2-WPRE-U6-spgRNA