化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)

　　化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)（或稱藥理遺傳學(xué)技術(shù)）是近年來與光遺傳學(xué)一起出現(xiàn)的重要新技術(shù)。該技術(shù)通過對一些生物大分子實行改造，使其能和先前無法識別的小分子進(jìn)行相互作用，從而達(dá)到可控、可逆（可以隨時加入或除去化合物，從而啟動或中斷特定的反應(yīng)）控制生物大分子的活性，該技術(shù)已經(jīng)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物開發(fā)、功能基因組學(xué)等方面的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。

　　他們被廣泛用于以細(xì)胞特異性、無創(chuàng)地增強(qiáng)或抑制神經(jīng)元的活動。雖然DREADD缺乏像光遺傳學(xué)那樣精準(zhǔn)的時間控制能力，但是由于在進(jìn)行疾病治療時，最有可能需要的是長期神經(jīng)元環(huán)路調(diào)節(jié)，而DREADDs會非常適合這類應(yīng)用。此外，許多FDA批準(zhǔn)藥物的目標(biāo)作用目標(biāo)是GPCRs，而DREADDs是改造過的GPCRs，因此DREADDs可能會在藥物開發(fā)方面提供豐富的可能性。

　　目前已改造的生物大分子包括核酸雜交、蛋白質(zhì)激酶、各種代謝酶和G蛋白耦聯(lián)受體（G protein?coupledreceptors，GPCRs）?，F(xiàn)在有很多基于GPCRs改造的化學(xué)遺傳學(xué)平臺，例如1991年構(gòu)建的基因編碼受體的等位基因特異激活（Allele-specific activation of genetically encoded receptors）、1998年構(gòu)建的只能被合成配體激活的受體（Receptorsactivated solely by synthetic ligands, RASSLs）、基因工程改造的受體（Engineered receptors）和2007年構(gòu)建的只由特定藥物激活的受體（Designer receptors exclusively activatedby designer drugs，DREADDs）。其中，DREADDs已成為應(yīng)用最廣泛的化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)，本文也將主要討論DREADDs技術(shù)。

　　圖1.化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)

　　1）DREADDs技術(shù)

　　DREADDs技術(shù)是由Bryan L. Roth等人發(fā)明的，他們改變了G蛋白偶聯(lián)受體—乙酰膽堿受體的結(jié)構(gòu)，改變后其只能被特定的化合物Clozapine-N-oxide（CNO）激活或者抑制。此類改變的受體會選擇性地作用于不同的GPCR級聯(lián)反應(yīng)，包括Gq、Gi、Gs、Golf和β-arrestin，其中應(yīng)用最廣泛的是Gq-DREADD和Gi-DREADD。通過將上述受體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，在CNO的作用下，其產(chǎn)生的結(jié)果各不相同。

　　圖2 常用的幾種DREADDs受體作用原理（Scott M. Sternson & Bryan L. Roth, Annu. Rev. Neurosci., 2014）

　　2）常見的DREADDs受體

　　1、Gq-DREADD和hM3Dq：

　　最初的Gq-DREADD即hM3Dq，改造自人毒蕈堿型乙酰膽堿受體（the human muscarinic acetylcholine receptor，mAchRs）亞型M3（也稱為hM3）。在正常生理狀況下，hM3和乙酰膽堿結(jié)合，然后和Gq類G蛋白耦合受體耦合，作用于磷脂酶C、肌醇三磷酸和胞內(nèi)鈣離子這一信號通路（圖3）。

　　令人吃驚地是，只要將Y3.33C和A5.46這兩個位點突變，就能使hM3受體不能和乙酰膽堿耦合，但是會和納摩爾濃度級別的CNO結(jié)合，這種突變后的hM3受體被命名為hM3Dq (human M3 muscarinic DREADD receptor coupled to Gq)。由于Y3.33和A5.46在不同的人毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型中是保守的，M1和M5也已經(jīng)被成功改造為Gq-DREADD（hM1Dq和hM5Dq）。但是到目前為止，hM3Dq仍然是應(yīng)用最多的Gq-DREADD。

　　在不同的細(xì)胞類型中，CNO誘導(dǎo)hM3Dq的結(jié)果是不一樣的，比如：1) 在成熟神經(jīng)元中，CNO誘導(dǎo)hM3Dq的結(jié)果是將神經(jīng)元去極化（depolarization），加強(qiáng)神經(jīng)元的興奮性，這也是hM3Dq最常用的功能，即促使神經(jīng)元的放電活動；2) 在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，有人報道CNO誘導(dǎo)hM3Dq的結(jié)果是增加星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca+的釋放，從而改變自主神經(jīng)系統(tǒng)的生理條件；3) 在神經(jīng)系統(tǒng)以外，也有一些研究，例如在胰腺Β細(xì)胞表達(dá)hM3Dq，急性CNO處理會促進(jìn)胰島素的釋放，而慢性CNO處理導(dǎo)致Β細(xì)胞數(shù)目增加；在肝細(xì)胞中，激活hM3Dq會增加血糖水平，也許是因為糖原分解和糖異生作用增加。

　　圖3. hM3和乙酰膽堿結(jié)合，作為信號分子激活Gq耦聯(lián)的GPCRs信號通路

　　2、Gi-DREADD和hM4Di:

　　Y3.33和A5.46在不同的人毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型中是保守的，因此科學(xué)家同樣可以突變M2和M4 mAchRs上的Y3.33、A5.46位點，由于M2、M4的下游激活的是Gi通道，于是產(chǎn)生Gi- DREADDs，命名為hM2Di和hM4Di，他們可以激活Gi調(diào)節(jié)的信號通路（圖4）。

　　Gi耦合的GPCRs可以激活G蛋白內(nèi)向整流鉀通道（GIRK），在CNO的作用下， hM2Di和hM4Di受體被激活可以抑制神經(jīng)元的放電活動，其中使用最多的Gi-DREADD是hM4Di。也有研究表明，hM4Di可以抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而達(dá)到抑制神經(jīng)元活動的效果。

　　圖4 hM4和乙酰膽堿結(jié)合，作為信號分子激活Gi耦聯(lián)的GPCRs信號通路

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　　3）DREADDs技術(shù)的應(yīng)用策略

　　借助病毒載體的DREADDs技術(shù)應(yīng)用一般包括以下幾個關(guān)鍵步驟（圖5）：

　　1、根據(jù)實驗?zāi)康?，確定合適的DREADDs受體，一般來說，激活神經(jīng)元選擇hM3Dq，抑制神經(jīng)元選擇hM4Di；

　　2、借助病毒載體在動物體內(nèi)表達(dá)DREADDs受體；

　　3、設(shè)計實驗方案，在合適的時間窗口內(nèi)給予動物CNO藥物，激活受體，給予CNO的方式包括腦內(nèi)定位注射、腹腔注射和喂水；

　　4、表型檢測，通過行為學(xué)或電生理手段等檢測神經(jīng)元活動變化帶來的變化。

　　圖5. DREADDs技術(shù)的一般策略

　　4）DREADDs技術(shù)優(yōu)勢

　　DREADDs技術(shù)和光遺傳學(xué)技術(shù)應(yīng)用起來非常接近，其目的也是同樣的，那么，九游會j9日常研究中如何對其進(jìn)行選擇？選擇的標(biāo)準(zhǔn)就是兩種技術(shù)的優(yōu)缺點分析：

　　DREADDs技術(shù)的優(yōu)勢主要有：

　　1、實驗要求較低，操作簡單：不像光遺傳學(xué)技術(shù)需要光纖、激光控制器等，DREADDs技術(shù)只需常規(guī)藥理學(xué)技術(shù)手法，注射或者喂食CNO即可；

　　2、非侵入性：不像光遺傳技術(shù)需進(jìn)行開顱手術(shù)埋置光纖，因此不會因為額外負(fù)重影響小鼠行為，可實現(xiàn)在小鼠完全自由活動的情況下調(diào)控特定腦區(qū)和特定神經(jīng)元的活動；

　　3、實現(xiàn)長時間激活或抑制神經(jīng)元活動：由于兩種技術(shù)原理不同，光遺傳學(xué)技術(shù)依賴的是光敏感通道的開放，是需要離子在細(xì)胞膜上的流動產(chǎn)生電位變化，影響神經(jīng)元活動，而長時間離子逆濃度差進(jìn)出細(xì)胞需消耗大量ATP（如離子泵），這會導(dǎo)致細(xì)胞受損死亡，此外光刺激的熱效應(yīng)同樣會損傷細(xì)胞。相比之下，DREADDs表達(dá)的是一種受體，可以長達(dá)數(shù)小時持續(xù)激活或抑制神經(jīng)元活動而不影響細(xì)胞正常生理；

　　4、安全性高：CNO是FDA批準(zhǔn)上市藥物-氯氮平的代謝產(chǎn)物，體內(nèi)應(yīng)用相對安全。此外，許多FDA批準(zhǔn)藥物的目標(biāo)作用目標(biāo)是GPCRs，而DREADDs是改造過的GPCRs，因此DREADDs可能會在藥物開發(fā)方面提供豐富的可能性。

　　表1 光遺傳與化學(xué)遺傳優(yōu)缺點比較

　　光遺傳學(xué)技術(shù) DREADDs技術(shù)

　　時間上時間精準(zhǔn)度到毫秒級別甚至是亞毫秒級小時級，可實現(xiàn)長達(dá)數(shù)小時持續(xù)激活或抑制神經(jīng)元活動而不影響細(xì)胞正常生理

　　空間上通過腦定位注射、特異性啟動子、亞細(xì)胞器定位肽，將光敏感蛋白錨定在靶向細(xì)胞或細(xì)胞器進(jìn)行操作，可達(dá)到單個細(xì)胞的級別通過定位注射、特異性啟動子將DREADDs受體錨定某類特定的細(xì)胞

　　操作技術(shù) 開顱手術(shù)埋置光纖，需要光纖、激光控制器等，操作相對有難度非浸入性，只需常規(guī)藥理學(xué)技術(shù)手法，注射或者喂食CNO即可

　　DREADDs技術(shù)應(yīng)用案例

　　1、hM4Di

　、客戶發(fā)表文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相關(guān)病毒, 癢, 光遺傳,化學(xué)遺傳]

　　注射部位：小鼠PBN

　　載體：AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine

　　血清型：AAV2/9

　　病毒滴度：1.0× 1013 VG/mL

　　注射體積：150nl

　　觀察時間：3周

　、客戶發(fā)表文章：Neuron . (IF=14.319). Xu HF, et al. (2019) A Disinhibitory Microcircuit Mediates Conditioned Social Fear in the Prefrontal Cortex. [社交恐懼癥, AAV，化學(xué)遺傳]