光遺傳學(xué)（optogenetics）是結(jié)合了光學(xué)（optics）及遺傳學(xué)（genetics）的技術(shù)，借助其，九游會(huì)j9能在活體動(dòng)物甚至是自由運(yùn)動(dòng)的動(dòng)物腦內(nèi)、脊髓、外周神經(jīng)內(nèi)，精準(zhǔn)地控制特定種類神經(jīng)元的活動(dòng)。光遺傳學(xué)在時(shí)間上的精確度可達(dá)到毫秒級(jí)別，在空間上的精確度則能達(dá)到單個(gè)細(xì)胞級(jí)別。2010年，光遺傳學(xué)被Nature Methods選為年度方法，同年被Science認(rèn)為是近十年來(lái)的突破之一。這項(xiàng)技術(shù)目前在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛，未來(lái)可能會(huì)應(yīng)用于多種神經(jīng)和精神疾病的治療，如帕金森氏病、阿爾茨海默病、癲癇、脊髓損傷、精神分裂癥等。
圖1.光遺傳學(xué)技術(shù)
1）光遺傳學(xué)技術(shù)發(fā)展史
談及光遺傳學(xué)技術(shù)的由來(lái)，九游會(huì)j9不得不思考神經(jīng)科學(xué)的基本研究需求：精確控制神經(jīng)元活動(dòng)。1979年，諾貝爾獎(jiǎng)得主Francis Harry Compton Crick首次提出，為了解大腦如何運(yùn)作，九游會(huì)j9需要一種方法，可以每次只讓某一特定類型神經(jīng)元活動(dòng)被抑制，而不影響其他神經(jīng)元的活動(dòng)。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，人們過(guò)去通常采用電刺激來(lái)激活一群神經(jīng)元活動(dòng)，但其具有兩大難以克服的缺點(diǎn)（圖2），其一在于該操作的非選擇性，即電場(chǎng)會(huì)同時(shí)刺激多種類型神經(jīng)元，所得出的研究結(jié)果往往缺乏特異性，其二是只能激活而無(wú)法抑制神經(jīng)元活動(dòng)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家開(kāi)始利用化學(xué)藥物聯(lián)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)精確定位特定的神經(jīng)元并進(jìn)行相關(guān)研究，盡管解決了特異性問(wèn)題，但是化學(xué)刺激的方法在時(shí)間上的精確度缺乏保證。因而，一種高精確性，能夠激活或抑制特定種類神經(jīng)元活動(dòng)的方法成為研究的“剛需”，光遺傳學(xué)技術(shù)正解決了此問(wèn)題。
圖2 光遺傳學(xué)與電刺激操控細(xì)胞的差異（Karl Deisseroth, et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 2014）
早在1973年，微生物學(xué)家便發(fā)現(xiàn)細(xì)菌視紫質(zhì)（Bacteriorhodosin）光照之后會(huì)成為離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，1977年發(fā)現(xiàn)鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)（Halorhodopsin，NpHR）也是離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，照黃綠光后會(huì)將陰離子打進(jìn)細(xì)胞，2002年發(fā)現(xiàn)光敏感通道（Channelrhodopsins），藍(lán)光照射之后會(huì)將陽(yáng)離子打進(jìn)細(xì)胞。
2005年9月份，斯坦福大學(xué)的Karl Deisseroth實(shí)驗(yàn)室在Nature Neuroscience上發(fā)表了一篇Technical Report，第一次將Channelrhodopsin-2（ChR2）表達(dá)在神經(jīng)元里，發(fā)現(xiàn)可以用藍(lán)光精確地控制神經(jīng)元的活動(dòng)（圖2），而光遺傳學(xué)（optogenetics）一詞也隨之出現(xiàn)。隨后發(fā)現(xiàn)Bacteriorhodosin與Halorhodopsin也都能在神經(jīng)元表達(dá)，準(zhǔn)確調(diào)控神經(jīng)元的活動(dòng)，并不會(huì)對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒害作用。此后，光遺傳學(xué)迅速改變神經(jīng)科學(xué)界，成為研究特定神經(jīng)元在大腦中扮演何種角色不可或缺的工具。
圖3.將ChR2表達(dá)在神經(jīng)元膜上，然后用470nm藍(lán)色激光進(jìn)行照射
2）光遺傳學(xué)技術(shù)基本原理
簡(jiǎn)單地說(shuō)，光遺傳學(xué)技術(shù)即借助遺傳學(xué)手段，將能夠?qū)馄痦憫?yīng)的通道表達(dá)在特定細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)通過(guò)光來(lái)激活或抑制神經(jīng)元活動(dòng)的目標(biāo)。其中，激活或抑制的原理在于不同通道對(duì)陽(yáng)離子或陰離子的通透（圖4）：如果轉(zhuǎn)入細(xì)胞的通道是ChR通道，那么在細(xì)胞接受藍(lán)色激光照射時(shí)通道開(kāi)放，陽(yáng)離子內(nèi)流，會(huì)產(chǎn)生去極化電位，誘發(fā)動(dòng)作電位的發(fā)出，激活細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)入細(xì)胞的是HR一類通道的話，細(xì)胞接受黃色激光照射時(shí)陰離子內(nèi)流，產(chǎn)生超極化電位，導(dǎo)致動(dòng)作電位不易發(fā)放，抑制細(xì)胞活動(dòng)；此外，還有一類光激活或抑制的通道optoXR，給光激活后其改變的是胞內(nèi)激酶系統(tǒng)，影響細(xì)胞活動(dòng)。因此，光遺傳學(xué)技術(shù)的核心技術(shù)差異在于光敏感通道的選擇。
圖4.光遺傳學(xué)的基本原理（以ChR2和NpHR為例）
3）常見(jiàn)的光敏感通道
幾種激活神經(jīng)元的通道蛋白：
1、ChR2(H134R)：ChR2的突變體，將第134個(gè)氨基酸由組胺酸突變?yōu)榫匪?，該蛋白質(zhì)可以產(chǎn)生兩倍的光電流，但通道開(kāi)關(guān)速度也比野生的ChR2慢了一倍；
2、ChR2(C128S/D156A): ChR2的突變體，超靈敏光敏感通道，用藍(lán)色激光打開(kāi)通道，然后用綠色或黃色激光關(guān)閉通道，可以打開(kāi)其離子通道長(zhǎng)達(dá)30分鐘；
3、ChR2(E123T/T159C): ChR2的突變體，更大的光電流和更快的動(dòng)力學(xué)變化；
4、ChETA：ChR2的突變體，使得神經(jīng)元在激光刺激下可以發(fā)放200Hz的spike，而其他的ChR2 通道蛋白只能達(dá)到40Hz；
5、C1V1：由ChR1及由團(tuán)藻發(fā)現(xiàn)的VChR1組合在一起的通道蛋白，在紅色激光刺激下打開(kāi)通道；
6、oChIEF：響應(yīng)高頻光（--100Hz）刺激，加速通道關(guān)閉的速度，在持續(xù)光照刺激下減少失活率；
7、ST-ChroME：胞體定位，激活型ChroME通道。
幾種抑制神經(jīng)元活動(dòng)的通道蛋白
1、NpHR：即為Halorhodopsin，第一個(gè)有效抑制神經(jīng)元活動(dòng)的光遺傳學(xué)工具，在黃綠激光照射下會(huì)將氯離子打進(jìn)神經(jīng)元內(nèi)，而抑制神經(jīng)元活動(dòng)。當(dāng)把NpHR表達(dá)在哺乳動(dòng)物腦內(nèi)時(shí)，會(huì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，而如果將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出元件加在NpHR基因序列后面，這樣可以使得NpHR在胞內(nèi)高量表達(dá)，而且不會(huì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，這樣修改過(guò)的NpHR被稱為eNpHR2.0。但是eNpHR2.0在細(xì)胞膜的聚集仍然不夠，而將一個(gè)高爾基體輸出元件和來(lái)自于鉀離子通道Kir2.1的上膜元件加在eNpHR2.0基因序列后面，這樣就能實(shí)現(xiàn)在神經(jīng)元細(xì)胞膜上的高量聚集，這樣修改過(guò)的NpHR被稱為eNpHR3.0，eNpHR3.0的響應(yīng)時(shí)間短，反應(yīng)靈敏。
2、Arch：即為archaerhodopsin，是一種黃色激光激活的外向整流質(zhì)子泵，能夠?qū)д姷馁|(zhì)子從神經(jīng)元內(nèi)移動(dòng)到細(xì)胞外環(huán)境中，使神經(jīng)元處于超極化狀態(tài)。在特定條件下，可用于增加細(xì)胞內(nèi)pH或減少細(xì)胞外基質(zhì)pH。和NpHR相比，當(dāng)激光關(guān)閉的時(shí)候，Arch立即從通道打開(kāi)狀態(tài)恢復(fù)到關(guān)閉狀態(tài)。
3、Mac:即為 Leptosphaeria maculans fungal opsins，藍(lán)色激光激活的質(zhì)子泵，能夠?qū)д姷馁|(zhì)子從神經(jīng)元內(nèi)移動(dòng)到細(xì)胞外環(huán)境中，使神經(jīng)元處于超極化狀態(tài)。
4、IRES-ST-eGtACR1：胞體定位，快速抑制。
圖5常見(jiàn)光敏感通道特性（Karl Deisseroth’s, Nat Methods,2012）
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4）光遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用策略
借助病毒載體的光遺傳學(xué)技術(shù)應(yīng)用一般包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟（圖6）：
1、 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求尋找合適的光敏蛋白；
2、通過(guò)病毒載體感染細(xì)胞，將光敏感通道表達(dá)在靶細(xì)胞中；
3、手術(shù)手段向腦中導(dǎo)入光纖，通過(guò)控制激光來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)的精準(zhǔn)控制；
4、選擇合適的病毒表達(dá)時(shí)間，結(jié)合行為實(shí)驗(yàn)設(shè)置合理的試驗(yàn)方案；
5、行為學(xué)手段或電生理手段驗(yàn)證。
圖6. 光遺傳學(xué)技術(shù)的一般策略（Karl Deisseroth, Scientific American, 2010）
5）光遺傳學(xué)技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1、時(shí)間精確度高：光遺傳技術(shù)可以通過(guò)控制激光使時(shí)間精準(zhǔn)度到毫秒級(jí)別甚至是亞毫秒級(jí)；
2、刺激的強(qiáng)度精確性高：光遺傳技術(shù)通過(guò)控制激光，可以精準(zhǔn)地、隨時(shí)地調(diào)節(jié)給神經(jīng)元刺激的強(qiáng)度，這對(duì)于某些刺激強(qiáng)度依賴的神經(jīng)環(huán)路研究有不可替代的優(yōu)勢(shì)；
3、空間特異性：光遺傳學(xué)技術(shù)可以通過(guò)腦定位注射、特異性啟動(dòng)子、甚至是亞細(xì)胞器定位肽，將光敏感蛋白錨定在靶向細(xì)胞或細(xì)胞器進(jìn)行操作，可達(dá)到單個(gè)細(xì)胞的級(jí)別，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定位；
4、作用工具多樣：目前人們已經(jīng)突變了一系列新的光敏感通道，這些通道的時(shí)間特性和激發(fā)光要求都不同，可根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇；
5、作用直接：不像DREADDs技術(shù)依賴于動(dòng)物代謝水平，光遺傳學(xué)技術(shù)通過(guò)激光操控細(xì)胞的激活或抑制，作用直接。
表1 光遺傳與化學(xué)遺傳優(yōu)缺點(diǎn)比較
光遺傳學(xué)技術(shù) DREADDs技術(shù)
時(shí)間上 時(shí)間精準(zhǔn)度到毫秒級(jí)別甚至是亞毫秒級(jí) 小時(shí)級(jí)，可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)持續(xù)激活或抑制神經(jīng)元活動(dòng)而不影響細(xì)胞正常生理
空間上 通過(guò)腦定位注射、特異性啟動(dòng)子、亞細(xì)胞器定位肽，將光敏感蛋白錨定在靶向細(xì)胞或細(xì)胞器進(jìn)行操作，可達(dá)到單個(gè)細(xì)胞的級(jí)別 通過(guò)定位注射、特異性啟動(dòng)子將DREADDs受體錨定某類特定的細(xì)胞
操作技術(shù) 開(kāi)顱手術(shù)埋置光纖，需要光纖、激光控制器等，操作相對(duì)有難度 非浸入性，只需常規(guī)藥理學(xué)技術(shù)手法，注射或者喂食CNO即可
光遺傳學(xué)應(yīng)用案例
1、oChIEF：
客戶發(fā)表文章：Nature. (IF=41.577). Yang Y,et.al. (2018). Ketamine blocks bursting in the lateral habenula to rapidly relieve depression. [腺相關(guān)病毒, 抑郁癥, 光遺傳]
注射部位：小鼠LHb
載體：AAV2/9-hSyn-oChIEF-tdTomato
血清型：AAV2/9
病毒滴度：6.29× 1012 VG/mL
注射體積：100nl
觀察時(shí)間：1個(gè)月
2、ChR2(H134R)& eNpHR3.0
客戶發(fā)表文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相關(guān)病毒, 癢, 光遺傳,化學(xué)遺傳]
注射部位：小鼠脊髓
載體：AAV-EF1a-DIO-ChR2(H134R)-mCherry& AAV-hSyn-eNpHR3.0-EYFP
血清型：rAAV2/9
病毒滴度：5.1× 1012 VG/mL&1.7× 1013 VG/mL
注射體積：400-600nl
