神經(jīng)環(huán)路示蹤

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神經(jīng)元之間的環(huán)路連接非常復(fù)雜，完整而準(zhǔn)確地顯示這些環(huán)路的結(jié)構(gòu)和變化，對(duì)揭示許多疾病的病因和新治療方法的開發(fā)具有非常重要的意義。

傳統(tǒng)的神經(jīng)示蹤方法如電鏡、Golgi染色、染料、肽類標(biāo)記物等可以顯示神經(jīng)元的形態(tài)和投射，少數(shù)示蹤劑如WGA、TTC等還可以實(shí)現(xiàn)跨突觸標(biāo)記，但這些方法都具有信號(hào)間接、方向不特異、跨突觸后信號(hào)衰減嚴(yán)重等缺點(diǎn)，最重要的是，這些染料無(wú)法攜帶基因，因此只能顯色。自20世紀(jì)80年代，Kristensson首次應(yīng)用單純皰疹病毒（HSV）跨突觸標(biāo)記神經(jīng)元后，各種各樣病毒載體在環(huán)路示蹤方面的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。

但需要注意的是，雖然這類嗜神經(jīng)病毒對(duì)于神經(jīng)環(huán)路的標(biāo)記具有很強(qiáng)的感染性和特異性，但其免疫原性很強(qiáng)，動(dòng)物往往在注射后數(shù)天死亡，無(wú)法進(jìn)行行為測(cè)試或者生理研究，目前更適用于尋找未知的神經(jīng)環(huán)路，此外此類病毒需要PII以上等級(jí)的實(shí)驗(yàn)室。因此，越來(lái)越多的研究使用AAV進(jìn)行環(huán)路示蹤標(biāo)記。由于AAV本身無(wú)復(fù)制能力，且其免疫原性極低，因而其不會(huì)造成大量的毒害，亦不會(huì)影響動(dòng)物的正常生理，故AAV成為最常用的環(huán)路示蹤工具病毒載體。

神經(jīng)元是具有極性的細(xì)胞，信息從上一級(jí)神經(jīng)元的軸突通過(guò)突觸傳遞到下一級(jí)神經(jīng)元的樹突，之后發(fā)生樹突、胞體的信息整合，并通過(guò)軸突再次發(fā)出。因此涉及神經(jīng)環(huán)路的標(biāo)記包括方向性（順向：胞體至軸突的標(biāo)記；逆向：軸突至胞體的標(biāo)記）和是否跨突觸兩大基本問(wèn)題。

神經(jīng)環(huán)路示蹤技術(shù)的目標(biāo)
（改自Peter L Strick, et al., eLS, 2011）

環(huán)路示蹤應(yīng)用案例

基于AAV的順向非跨突觸標(biāo)記

①客戶發(fā)表文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相關(guān)病毒, 癢, 光遺傳,化學(xué)遺傳]

注射部位：小鼠PBN
載體：AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine
血清型：AAV2/9
病毒滴度：1.0E+13VG/mL
注射體積：150nl
觀察時(shí)間：3周

②客戶發(fā)表文章：Neuron. (IF=14.319). Tian-Le Xu,et.al. (2019). Central Processing of Itch in the Midbrain Reward Center. [AAV，癢，光遺傳學(xué)]

注射部位：Vgat- Cre小鼠VTA
載體：AAV-EF1a-DIO-ChR2(H134R)-mCherry
血清型：AAV2/8
病毒滴度：7.39E+12VG/mL
注射體積：300-400nl
觀察時(shí)間：2-3周

基于AAV的逆向非跨突觸標(biāo)記—rAAV2/retro

①客戶發(fā)表文章：Biological Psychiatry. (IF=11.984). Bing Xing Pan,et.al. (2018). Chronic stress causes projection-specific adaptation of amygdala neurons via SK channel downregulation. [腺相關(guān)病毒, 焦慮癥, 光遺傳]

注射部位：小鼠dmPFC、VHPC
載體：AAV2/1-retro-Syn-eYFP-Cre、AAV2/8-CaMKIIα-DO-SK2&AAV2/8-CaMKIIα-DIO-SK2-mCherry
注射體積：300nl
觀察時(shí)間：4周

②內(nèi)部測(cè)試結(jié)果

注射部位：小鼠BPN
載體：rAAV2-retro-hSyn-EYFP
觀察時(shí)間：4周

基于AAV的跨突觸標(biāo)記

1 、基于AAV的順向跨突觸標(biāo)記-- rAAV2/1
①客戶發(fā)表文章：Nature Neuroscience. (IF=19.912). Yao J,et.al. (2018). A corticopontine circuit for initiation of urination. [腺相關(guān)病毒, 神經(jīng)環(huán)路]

注射部位：小鼠皮層M1、PMC
載體：rAAV2/1-hSyn-Cre&rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherry、rAAV2/9-DIO-GCaMP6s
病毒滴度：rAAV2/1: 5E+12VG/mL；rAAV2/9-DIO-hChR2：1.2E+13VG/mL；rAAV2/9-DIO-GCaMP6s：0.5E+12VG/mL
注射體積：多點(diǎn)注射，每位點(diǎn)30-40nl
觀察時(shí)間：4周

②客戶發(fā)表文章：Science Advances. (IF=11.511). Ping Zheng,et.al. (2019). Crucial role of feedback signals from prelimbic cortex to basolateral amygdala in the retrieval of morphine withdrawal memory. [腺相關(guān)病毒, 成癮, AAV1, AAV-WGA-Cre]

注射部位：小鼠皮層BLA
載體：rAAV2/1-hSyn-Cre-EGFP
病毒滴度： 1.13E+13VG/mL
注射體積：60nl
觀察時(shí)間：5周

2 、借助WGA的跨突觸標(biāo)記—AAV-WGA-Cre
客戶發(fā)表文章：Science Advances. (IF=11.511). Ping Zheng,et.al. (2019). Crucial role of feedback signals from prelimbic cortex to basolateral amygdala in the retrieval of morphine withdrawal memory. [腺相關(guān)病毒, 成癮, AAV1, AAV-WGA-Cre]