光遺傳學技術

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光遺傳學（optogenetics）是結合了光學（optics）及遺傳學（genetics）的技術，借助其，九游會j9能在活體動物甚至是自由運動的動物腦內、脊髓、外周神經內，精準地控制特定種類神經元的活動。光遺傳學在時間上的精確度可達到毫秒級別，在空間上的精確度則能達到單個細胞級別。2010年，光遺傳學被Nature Methods選為年度方法，同年被Science認為是近十年來的突破之一。這項技術目前在神經科學領域應用非常廣泛，未來可能會應用于多種神經和精神疾病的治療，如帕金森氏病、阿爾茨海默病、癲癇、脊髓損傷、精神分裂癥等。

光遺傳學技術發(fā)展史
談及光遺傳學技術的由來，九游會j9不得不思考神經科學的基本研究需求：精確控制神經元活動。1979年，諾貝爾獎得主Francis Harry Compton Crick首次提出，為了解大腦如何運作，九游會j9需要一種方法，可以每次只讓某一特定類型神經元活動被抑制，而不影響其他神經元的活動。為了實現(xiàn)這個目標，人們過去通常采用電刺激來激活一群神經元活動，但其具有兩大難以克服的缺點，其一在于該操作的非選擇性，即電場會同時刺激多種類型神經元，所得出的研究結果往往缺乏特異性，其二是只能激活而無法抑制神經元活動。隨著基因工程技術的發(fā)展，科學家開始利用化學藥物聯(lián)合轉基因技術來精確定位特定的神經元并進行相關研究，盡管解決了特異性問題，但是化學刺激的方法在時間上的精確度缺乏保證。因而，一種高精確性，能夠激活或抑制特定種類神經元活動的方法成為研究的“剛需”，光遺傳學技術正解決了此問題。

光遺傳學與電刺激操控細胞的差異
（Karl Deisseroth, et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 2014）

早在1973年，微生物學家便發(fā)現(xiàn)細菌視紫質（Bacteriorhodosin）光照之后會成為離子轉運蛋白，1977年發(fā)現(xiàn)鹽細菌視紫紅質（Halorhodopsin，NpHR）也是離子轉運蛋白，照黃綠光后會將氯離子流入細胞，2002年發(fā)現(xiàn)光敏感通道（Channelrhodopsins），藍光照射之后會將陽離子打進細胞。

2005年9月份，斯坦福大學的Karl Deisseroth實驗室在Nature Neuroscience上發(fā)表了一篇Technical Report，第一次將Channelrhodopsin-2（ChR2）表達在神經元里，發(fā)現(xiàn)可以用藍光精確地控制神經元的活動，而光遺傳學（optogenetics）一詞也隨之出現(xiàn)。隨后發(fā)現(xiàn)Bacteriorhodosin與Halorhodopsin也都能在神經元表達，準確調控神經元的活動，并不會對神經元產生毒害作用。此后，光遺傳學迅速改變神經科學界，成為研究特定神經元在大腦中扮演何種角色不可或缺的工具。

光遺傳學技術基本原理
簡單地說，光遺傳學技術即借助遺傳學手段，將能夠對光起響應的通道蛋白表達在特定細胞中，實現(xiàn)通過光來激活或抑制神經元活動的目標。其中，激活或抑制的原理在于不同通道對陽離子或陰離子的通透：如果轉入細胞的通道是ChR通道，那么在細胞接受藍色激光照射時通道開放，陽離子內流，會產生去極化電位，誘發(fā)動作電位的發(fā)出，激活細胞；如果轉入細胞的是HR一類通道的話，細胞接受黃色激光照射時陰離子內流，產生超極化電位，導致動作電位不易發(fā)放，抑制細胞活動；此外，還有一類光激活或抑制的通道optoXR，給光激活后其改變的是胞內激酶系統(tǒng)，影響細胞活動。因此，光遺傳學技術的核心技術差異在于光敏感通道的選擇。

光遺傳學的基本原理
（Karl Deisseroth, et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 2014）

常見的光敏感通道

幾種激活神經元的通道蛋白：

幾種抑制神經元活動的通道蛋白

光遺傳學技術的應用策略
借助病毒載體的光遺傳學技術應用一般包括以下幾個關鍵步驟：
1、根據實驗需求尋找合適的光敏蛋白；
2、通過病毒載體感染細胞，將光敏感通道表達在靶細胞中；
3、手術手段向腦中導入光纖，通過控制激光來實現(xiàn)對神經元活動的精準控制；
4、選擇合適的病毒表達時間，結合行為實驗設置合理的試驗方案；
5、行為學手段或電生理手段驗證。

光遺傳學技術的一般策略
（Karl Deisseroth, Scientific American, 2010）

光遺傳學技術優(yōu)勢
1、時間精確度高：光遺傳技術可以通過控制激光使時間精準度到毫秒級別甚至是亞毫秒級；
2、刺激的強度精確性高：光遺傳技術通過控制激光，可以精準地、隨時地調節(jié)給神經元刺激的強度，這對于某些刺激強度依賴的神經環(huán)路研究有不可替代的優(yōu)勢；
3、空間特異性：光遺傳學技術可以通過腦定位注射、特異性啟動子、甚至是亞細胞器定位肽，將光敏感蛋白錨定在靶向細胞或細胞器進行操作，可達到單個細胞的級別，實現(xiàn)精準定位；
4、作用工具多樣：目前人們已經突變了一系列新的光敏感通道，這些通道的時間特性和激發(fā)光要求都不同，可根據具體的實驗需求進行選擇；
5、作用直接：不像DREADDs技術依賴于動物代謝水平，光遺傳學技術通過激光操控細胞的激活或抑制，作用直接。

光遺傳學應用案例
1、ChR2(H134R)& eNpHR3.0
客戶發(fā)表文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相關病毒, 癢, 光遺傳,化學遺傳]

注射部位：小鼠脊髓
載體：AAV-EF1a-DIO-ChR2(H134R)-mCherry& AAV-hSyn-eNpHR3.0-EYFP
血清型：rAAV2/9
病毒滴度：5.1E+12 VG/mL&1.7E+13 VG/mL
注射體積：400-600nl

2、oChIEF：
客戶發(fā)表文章：Nature. (IF=41.577). Yang Y,et.al. (2018). Ketamine blocks bursting in the lateral habenula to rapidly relieve depression. [腺相關病毒, 抑郁癥, 光遺傳]