化學遺傳學技術

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化學遺傳學技術（或稱藥理遺傳學技術）是近年來與光遺傳學一起出現(xiàn)的重要新技術。該技術通過對一些生物大分子實行改造，使其能和先前無法識別的小分子進行相互作用，從而達到可控、可逆（可以隨時加入或除去化合物，從而啟動或中斷特定的反應）控制生物大分子的活性，該技術已經在信號轉導、藥物開發(fā)、功能基因組學等方面的研究中得到了廣泛的應用。

目前已改造的生物大分子包括核酸雜交、蛋白質激酶、各種代謝酶和G蛋白耦聯(lián)受體（G protein?coupledreceptors，GPCRs）。現(xiàn)在有很多基于GPCRs改造的化學遺傳學平臺，例如1991年構建的基因編碼受體的等位基因特異激活（Allele-specific activation of genetically encoded receptors）、1998年構建的只能被合成配體激活的受體（Receptorsactivated solely by synthetic ligands, RASSLs）、基因工程改造的受體（Engineered receptors）和2007年構建的只由特定藥物激活的受體（Designer receptors exclusively activatedby designer drugs，DREADDs）。其中，DREADDs已成為應用最廣泛的化學遺傳學技術。

DREADD技術被廣泛用于以細胞特異性、無創(chuàng)地增強或抑制神經元的活動。雖然DREADD缺乏像光遺傳學那樣精準的時間控制能力，但是由于在進行疾病治療時，最有可能需要的是長期神經元環(huán)路調節(jié)，而DREADDs會非常適合這類應用。此外，許多FDA批準藥物的目標作用目標是GPCRs，而DREADDs是改造過的GPCRs，因此DREADDs可能會在藥物開發(fā)方面提供豐富的可能性。

DREADDs技術
DREADDs技術是由Bryan L. Roth等人發(fā)明的，他們改變了G蛋白偶聯(lián)受體—乙酰膽堿受體的結構，改變后其只能被特定的化合物Clozapine-N-oxide（CNO）激活或者抑制。此類改變的受體會選擇性地作用于不同的GPCR級聯(lián)反應，包括Gq、Gi、Gs、Golf和β-arrestin，其中應用最廣泛的是Gq-DREADD和Gi-DREADD。通過將上述受體在細胞內表達，在CNO的作用下，其產生的結果各不相同。

常用DREADDs受體作用原理
（Scott M. Sternson & Bryan L. Roth, Annu. Rev. Neurosci., 2014）

常見的DREADDs受體

Gq-DREADD和hM3Dq：

最初的Gq-DREADD即hM3Dq，改造自人毒蕈堿型乙酰膽堿受體（the human muscarinic acetylcholine receptor，mAchRs）亞型M3（也稱為hM3）。在正常生理狀況下，hM3和乙酰膽堿結合，然后和Gq類G蛋白耦合受體耦合，作用于磷脂酶C、肌醇三磷酸和胞內鈣離子這一信號通路。

令人吃驚地是，只要將Y3.33C和A5.46這兩個位點突變，就能使hM3受體不能和乙酰膽堿耦合，但是會和納摩爾濃度級別的CNO結合，這種突變后的hM3受體被命名為hM3Dq (human M3 muscarinic DREADD receptor coupled to Gq)。

在不同的細胞類型中，CNO誘導hM3Dq的結果是不一樣的，比如：1) 在成熟神經元中，CNO誘導hM3Dq的結果是將神經元去極化（depolarization），加強神經元的興奮性，這也是hM3Dq最常用的功能，即促使神經元的放電活動；2) 在星形膠質細胞中，有人報道CNO誘導hM3Dq的結果是增加星形膠質細胞Ca+的釋放，從而改變自主神經系統(tǒng)的生理條件；3) 在神經系統(tǒng)以外，也有一些研究，例如在胰腺Β細胞表達hM3Dq，急性CNO處理會促進胰島素的釋放，而慢性CNO處理導致Β細胞數(shù)目增加；在肝細胞中，激活hM3Dq會增加血糖水平，也許是因為糖原分解和糖異生作用增加。

Gi-DREADD和hM4Di:

Y3.33和A5.46在不同的人毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型中是保守的，因此科學家同樣可以突變M2和M4 mAchRs上的Y3.33、A5.46位點，由于M2、M4的下游激活的是Gi通道，于是產生Gi-DREADDs，命名為hM2Di和hM4Di，他們可以激活Gi調節(jié)的信號通路。

Gi耦合的GPCRs可以激活G蛋白內向整流鉀通道（GIRK），在CNO的作用下， hM2Di和hM4Di受體被激活可以抑制神經元的放電活動，其中使用最多的Gi-DREADD是hM4Di。也有研究表明，hM4Di可以抑制神經遞質的釋放，從而達到抑制神經元活動的效果。

DREADDs技術的應用策略

借助病毒載體的DREADDs技術應用一般包括以下幾個關鍵步驟：
1、根據(jù)實驗目的，確定合適的DREADDs受體，一般來說，激活神經元選擇hM3Dq，抑制神經元選擇hM4Di；
2、借助病毒載體在動物體內表達DREADDs受體；
3、設計實驗方案，在合適的時間窗口內給予動物CNO藥物，激活受體，給予CNO的方式包括腦內定位注射、腹腔注射和喂水；
4、表型檢測，通過行為學或電生理手段等檢測神經元活動變化帶來的變化。

DREADDs技術優(yōu)勢

1、實驗要求較低，操作簡單：不像光遺傳學技術需要光纖、激光控制器等，DREADDs技術只需常規(guī)藥理學技術手法，注射或者喂食CNO即可。
2、非侵入性：不像光遺傳技術需進行開顱手術埋置光纖，因此不會因為額外負重影響小鼠行為，可實現(xiàn)在小鼠完全自由活動的情況下調控特定腦區(qū)和特定神經元的活動。
3、實現(xiàn)長時間激活或抑制神經元活動：由于兩種技術原理不同，光遺傳學技術依賴的是光敏感通道的開放，是需要離子在細胞膜上的流動產生電位變化，影響神經元活動，而長時間離子逆濃度差進出細胞需消耗大量ATP（如離子泵），這會導致細胞受損死亡，此外光刺激的熱效應同樣會損傷細胞。相比之下，DREADDs表達的是一種受體，可以長達數(shù)小時持續(xù)激活或抑制神經元活動而不影響細胞正常生理。
4、安全性高：CNO是FDA批準上市藥物-氯氮平的代謝產物，體內應用相對安全。此外，許多FDA批準藥物的目標作用目標是GPCRs，而DREADDs是改造過的GPCRs，因此DREADDs可能會在藥物開發(fā)方面提供豐富的可能性。

DREADDs技術應用案例

hM4D(Gi)

①客戶發(fā)表文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [AAV，癢, 光遺傳,化學遺傳]

注射部位：小鼠PBN
載體：AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine
血清型：AAV2/9
病毒滴度：1E+13 VG/mL
注射體積：150nl
觀察時間：3周

②客戶發(fā)表文章：Cell Stem Cell. (IF=21.464). Jie Zheng, et al. (2020) Interneuron Accumulation of Phosphorylated tau Impairs Adult Hippocampal Neurogenesis by Suppressing GABAergic Transmission. [AAV，AD，化學遺傳]