時間：2022-09-23 熱度：

CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其應(yīng)用
 

隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的興起，實(shí)現(xiàn)了對動植物基因組編輯的廣泛應(yīng)用。CRISPR/Cas9技術(shù)源自Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)，Cas9是一種核酸內(nèi)切酶，雙tracrRNA:crRNA設(shè)計(jì)成為單向?qū)蛄校╯gRNA），其5’端的20個核苷酸序列通過堿基互補(bǔ)配對原則與靶位點(diǎn)的DNA結(jié)合，3’端與Cas9蛋白結(jié)合。sgRNA與DNA靶序列特異性結(jié)合，使Cas9能夠在特異性位點(diǎn)使靶細(xì)胞基因組DNA雙鏈斷裂（如圖1）。隨后，靶細(xì)胞通過非同源端連接產(chǎn)生InDels，實(shí)現(xiàn)基因敲除；或提供dsDNA供體模板通過同源重組修復(fù)的方法實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)突變或是基因插入。對Cas9蛋白關(guān)鍵活性位點(diǎn)D10A和H840A進(jìn)行突變后，使Cas9喪失催化活性但不影響其與目標(biāo)DNA序列結(jié)合的能力。這種突變的Cas9蛋白被稱為dCas9，可應(yīng)用于CRISPR激活（CRISPRa：dCas9與單個轉(zhuǎn)錄激活因子VP64連接可激活目的基因），亦可用于CRISPR干擾 (CRISPRi：dCas9與轉(zhuǎn)錄抑制子KRAB融合后結(jié)合到靶基因TSS位點(diǎn)抑制轉(zhuǎn)錄起始，沉默靶基因的表達(dá)) 。

 

圖1：CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作流程

Jennifer A. Doudna et al., Science. 2014 Nov 28;346(6213):1258096.

 

CRISPR/Cas9系統(tǒng)操作簡單，可針對任何感興趣的靶基因設(shè)計(jì)不同的sgRNA，且擁有獨(dú)特的DNA切割機(jī)制、多重靶點(diǎn)識別能力等特點(diǎn)，能夠精確、高效地靶向、編輯、修改、調(diào)節(jié)和標(biāo)記各種細(xì)胞和生物的基因組位點(diǎn)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的誕生，使堿基編輯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳編輯、基因組規(guī)模的篩選以及細(xì)胞和胚胎治療等方面得到廣泛的發(fā)展和應(yīng)用，CRISPR/Cas9文庫的應(yīng)用也讓基礎(chǔ)研究中大規(guī)模的基因組編輯和篩選成為現(xiàn)實(shí)。在篩選功能增益方面CRISPRa比較有效；在篩選缺失功能方面CRISPRi文庫較RNAi文庫更有效。

 

慢病毒載體是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的主要載體之一，因慢病毒有適用宿主范圍廣、感染效率高、具有生物安全性、整合基因到宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9文庫對靶細(xì)胞有效且準(zhǔn)確的基因編輯。下面就一起來了解慢病毒載體和CRISPR/Cas9相關(guān)的基因編輯系統(tǒng)如何應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。

案例1——慢病毒＆CRISPR/Cas9文庫（全基因組文庫）

Elaiophylin triggers paraptosis and preferentially kills ovarian cancer drug-resistant cells by inducing MAPK hyperactivation

作者單位：華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院

IF:38.104

 

精細(xì)調(diào)節(jié)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路對癌細(xì)胞的存活很重要。經(jīng)前期化合物庫的篩選確定了茶葉素是一種自噬抑制劑。在本研究中證明了茶葉素在多種癌細(xì)胞中通過過度激活MAPK通路誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的細(xì)胞質(zhì)空泡化以及隨后的細(xì)胞凋亡的作用。CRISPR/Cas9全基因組敲除文庫篩選鑒定出MAPK通路中的SHP2是茶葉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)。細(xì)胞熱位移實(shí)驗(yàn)(CETSA)和表面等離子體共振(SPR)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了SHP2與茶葉素直接結(jié)合。通過SHP2敲低或藥理抑制SHP2/SOS1/MAPK通路明顯減弱了茶葉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬抑制。茶葉素通過觸發(fā)細(xì)胞凋亡來克服耐藥性，這提示茶葉素可能為難治性卵巢癌提供一種合理的治療策略。

 

圖2：全基因組CRISPR/Cas9敲除文庫篩流程及茶葉素誘導(dǎo)自噬抑制示意圖。

Guan-Nan Li et al., Signal Transduction and Targeted Therapy. 2022 Sep 12;7(1):317.

 

★文庫來源：購買自Addgene (#1000000049)

 

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案例2——慢病毒＆CRISPR/Cas9文庫（激活文庫）

Genome-wide CRISPR screen identifies MTA3 as an inducer of gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarci

作者單位：天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院

IF:9.756

 

臨床胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)治療失敗的主要原因之一是產(chǎn)生吉西他濱(GEM)耐藥。作者通過CRISPR/Cas9激活文庫篩選發(fā)現(xiàn)MTA3介導(dǎo)了PDAC的GEM耐藥，因此MTA3可能成為潛在聯(lián)合化療的治療靶點(diǎn)。CRISPR文庫篩選顯示MTA3是GEM處理后存活細(xì)胞中富集最多的基因，生物信息學(xué)和組織學(xué)分析提示其與GEM耐藥高度相關(guān)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)MTA3可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞對GEM的耐藥。機(jī)制上，MTA3作為Mi-2/核小體重塑和去乙酰化酶轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物的組成部分，抑制NF-κB/p65的轉(zhuǎn)錄抑制因子CRIP2的轉(zhuǎn)錄，激活NF-κB信號通路，從而導(dǎo)致GEM耐藥。此外，GEM可通過激活STAT3信號通路上調(diào)PDAC細(xì)胞中MTA3的表達(dá)，從而誘導(dǎo)PDAC對GEM產(chǎn)生獲得性耐藥。MTA3在胰腺癌GEM耐藥中起關(guān)鍵作用，有望成為逆轉(zhuǎn)GEM耐藥的治療靶點(diǎn)。

 

圖3：利用CRISPR激活文庫篩選MTA3作為潛在的GEM耐藥相關(guān)基因。

Liangliang Wu et al., Cancer Lett. 2022 Aug 15;548:215864.

 

★文庫來源：人類CRISPR激活文庫購買自Addgene(#1000000078)

 

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案例3——慢病毒＆CRISPR/Cas9文庫（lncRNA激活文庫）

Lnc-DC promotes estrogen independent growth and tamoxifen resistance in breast cancer

作者單位：杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院

IF:9.685

 

選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)—他莫昔芬已被證明在雌激素受體(ER)陽性乳腺癌的治療中是有效的。然而，這種內(nèi)分泌治療的主要障礙是雌激素非依賴性生長導(dǎo)致的耐藥，其潛在機(jī)制尚不完全清楚。本研究探討了長鏈非編碼RNA (lncRNAs)是否參與調(diào)控ER陽性乳腺癌的雌激素非依賴性生長和他莫昔芬耐藥。研究基于CRISPR/Cas9的SAM(協(xié)同激活介質(zhì))文庫確定了候選Lnc-DC。通過分析表明，Lnc-DC能夠通過上調(diào)抗凋亡基因Bcl2和Bcl-xL來減少他莫昔芬誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，Lnc-DC通過磷酸化(pSTAT3^Y705)激活STAT3，隨后誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)而激活STAT3，形成自分泌環(huán)路。臨床上，Lnc-DC高表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)，本研究證明Lnc-DC/STAT3/細(xì)胞因子軸在雌激素非依賴性生長導(dǎo)致他莫昔芬耐藥中的功能，Lnc-DC可能是他莫昔芬應(yīng)答的潛在預(yù)測因子。

 

圖4：鑒定Lnc-DC參與雌激素非依賴性和他莫昔芬耐藥。

Wan-Xin Peng et al., Cell Death and Disease. 2021 Oct 25;12(11):1000.

 

★文庫來源：雙載體SAM文庫，購買自Addgene(#61426、#61425)

 

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案例4——慢病毒＆CRISPR/Cas9文庫（定制文庫）

Targeting euchromatic histone lysine methyltransferases sensitizes colorectal cancer to histone deacetylase inhibitors

作者單位：德國癌癥研究中心(DKFZ)

IF:7.316

 

結(jié)直腸癌(CRC)一個重要的特征是表觀遺傳失調(diào)。針對晚期癌癥，表觀遺傳藥物與抗腫瘤藥物結(jié)合是一種有前景的治療策略。作者利用合成致死的概念來識別與組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑協(xié)同作用以降低CRC生長的表觀遺傳靶點(diǎn)。研究使用針對614個表觀遺傳調(diào)節(jié)因子定制sgRNA文庫進(jìn)行CRISPR/Cas9篩。⑾智貿(mào)Ｈ舊首櫚鞍桌蛋彼酦-甲基轉(zhuǎn)移酶1和2 (EHMT1/2)顯著增強(qiáng)了臨床使用的HDAC抑制劑的抗增殖作用。通過對1066例不同腫瘤分期的結(jié)直腸癌樣本進(jìn)行組織芯片分析，發(fā)現(xiàn)EHMT2蛋白在晚期結(jié)直腸癌低表達(dá)，且與不良臨床結(jié)局相關(guān)。機(jī)制上，協(xié)同抑制HDAC和EHMT1/2可引起減少腫瘤細(xì)胞生長的不同機(jī)制，包括細(xì)胞周期阻滯和自噬的調(diào)節(jié)。表觀遺傳水平上，這些化合物增加H3K9乙?；?，降低H3K9二甲基化。功能表型上，協(xié)同抑制HDAC和EHMT1/2可降低患者來源的CRC類器官腫瘤的活力。

 

圖5：聚焦CRISPR/Cas9篩選確定EHMT1和EHMT2敲除對HDAC抑制劑的增敏作用。

Leonhard Valentin Bamberg et al., Int. J. Cancer. 2022;151:1586–1601.

 

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九游會j9生物常用文庫列表

 

 

九游會j9生物體內(nèi)及體外的功能基因篩選方案

 

 

 

九游會j9生物可供篩選表型包括

· 腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因篩選-體內(nèi)
· 細(xì)胞遷移/侵襲相關(guān)基因篩選-體外

· 細(xì)胞克隆形成相關(guān)基因篩選-體外

· 細(xì)胞增殖相關(guān)基因篩選-體外
· 腫瘤耐藥相關(guān)基因篩選-體外

· ......

 

九游會j9生物一直致力于病毒載體的研制服務(wù)，擁有10萬+的病毒包裝經(jīng)驗(yàn)/4.6萬+病毒載體庫，包裝GMP級別的病毒質(zhì)粒。九游會j9生物擁有多種慢病毒包裝系統(tǒng)：三質(zhì)粒/四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)。

 

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