前言
 

長骨節(jié)段性缺損較難愈合一直是阻礙骨再生醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要問題。重組蛋白臨床應(yīng)用價格昂貴且用量多副作用大，已經(jīng)不能滿足日益提高的醫(yī)療需求。美國梅奧康復(fù)醫(yī)學(xué)中心聯(lián)合MERLN創(chuàng)新再生醫(yī)學(xué)研究所的團隊近日在Science Advances發(fā)表了題為‘Efficient healing of large osseous segmental defects using optimized chemically modified messenger RNA encoding BMP-2’的文章。文中應(yīng)用通過化學(xué)修飾的mRNA替代重組蛋白遞送到大鼠骨折部位促進骨重建再生，為骨愈合治療提供了一種創(chuàng)新、安全、可轉(zhuǎn)化的技術(shù)。

 

背景介紹

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)，是一組具有類似結(jié)構(gòu)的高度保守的功能蛋白，屬于TGF-β家族。BMP能刺激DNA的合成和細(xì)胞的復(fù)制，促進MSCs定向分化為成骨細(xì)胞。它還是體內(nèi)誘導(dǎo)骨和軟骨形成的主要因子，并在肢體生長、骨折早期、軟骨修復(fù)時表達，對骨骼的發(fā)育和再生修復(fù)起到重要作用。

再生醫(yī)學(xué)為修復(fù)骨缺損和產(chǎn)生再生骨提供了新的解決方案。重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（rhBMP-2）等重組蛋白類新藥已被批準(zhǔn)在美國使用，但該類新藥展現(xiàn)出的治療效果卻差強人意。尋找一種高效安全的局部基因遞送方法成為更具有前景的研究思路。

mRNA是基因和其編碼蛋白之間的媒介。與DNA療法不同，不存在插入突變或其他遺傳損傷的風(fēng)險。編碼特異性治療蛋白的合成mRNA容易制備，并且可以通過廉價的非病毒載體遞送到細(xì)胞內(nèi)。但mRNA的不穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性和炎癥特性阻礙了其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，對mRNA進行結(jié)構(gòu)修飾和脂質(zhì)載體遞送同樣也是目前研究重點。

文章中研究者評估了一種化學(xué)修飾的mRNA（cmRNA）編碼的BMP-2修復(fù)大鼠股骨嚴(yán)重節(jié)段性缺損的能力。新生骨顯示出與天然骨相當(dāng)?shù)牧W(xué)性能，且沒有重組蛋白使用后形成的大量骨痂。該研究提示了轉(zhuǎn)錄療法在加速骨愈合方面的有效性和安全性。

研究內(nèi)容

01

為了研究化學(xué)修飾的mRNA（cmRNA）的安全性和體內(nèi)藥物代謝，研究者對中段骨缺損的大鼠原位注射了攜帶螢火蟲熒光素酶Fluc的cmRNA并進行活體成像，在除治療部位外的其他身體部位未觀察到熒光。給予cmRNA治療后，體內(nèi)產(chǎn)生大量的BMP-2蛋白，注射后第5天，蛋白質(zhì)表達衰減至低水平。相比之下，應(yīng)用重組人BMP-2蛋白在第1天達到高點后就開始逐漸減弱。該研究提示局部應(yīng)用cmRNA的可行性及cmRNA藥物代謝的優(yōu)勢。

Figure 1. Single application of FLuc cmRNA induces robust and localized luciferase activity in the bone but is absent from the circulation and essential organs.

02

研究者接下來對cmRNA應(yīng)用的劑量依賴性進行了探究。當(dāng)原位給予25ug及以上的cmRNA時產(chǎn)生的BMP-2蛋白能夠愈合骨缺損。給藥4周后，25ug的cmRNA劑量下骨愈合率為50%，50ug的劑量下動物骨缺損完全愈合。并且在使用cmRNA的愈合過程中，未觀察到rhBMP-2引起的大量異位骨痂形成。μCT結(jié)果顯示cmRNA組和rhBMP-2組新生骨小梁更。切×漢穸、數(shù)量和骨小梁分離度均相似。rhBMP-2組在治療4-8周過程中存在骨丟失加速的現(xiàn)象，而cmRNA組則表現(xiàn)穩(wěn)定。提示了應(yīng)用cmRNA治療的可取性。

在力學(xué)方面，愈合會恢復(fù)長骨的失效扭矩值。cmRNA組在治療4周時恢復(fù)了天然骨的失效扭矩值，而此時rhBMP-2組的失效扭矩值仍然顯著低于正常。8周時，僅cmRNA組的失效扭矩顯著高于正常骨組。這表明cmRNA的作用可能使骨機械強度恢復(fù)更快。

Figure 2. Bone healing with BMP-2 cmRNA is dose-dependent; doses >25ug are necessary to heal critically sized bone defects reliably in rats.

03

研究者應(yīng)用PCR芯片對cmRNA及rhBMP-2影響的成骨和基質(zhì)形成相關(guān)基因進行了批量檢測，結(jié)果顯示二者均刺激了骨細(xì)胞外基質(zhì)關(guān)鍵成分膠原、骨連接蛋白及轉(zhuǎn)化生長因子等轉(zhuǎn)錄本上調(diào)。同時參與骨重塑的酶如基質(zhì)金屬蛋白酶和組織蛋白酶K也上調(diào)，提示骨缺陷修復(fù)過程中礦化組織環(huán)境的高度活躍。而只有cmRNA影響II型和X型膠原的轉(zhuǎn)錄本。II型膠原是軟骨細(xì)胞的標(biāo)志，X型膠原是軟骨細(xì)胞肥大和軟骨內(nèi)骨化的標(biāo)志。因此治療方式的不同會導(dǎo)致骨愈合過程的差異，cmRNA引起軟骨內(nèi)骨化，rhBMP-2引起膜內(nèi)骨化。

Figure 3.  Expression of relevant osteogenic and extracellular matrix–related genes in newly formed tissue.

04

組織學(xué)檢查證實cmRNA組和rhBMP-2組在4周和8周時骨缺損被橋接。Masson和HE染色均顯示有皮質(zhì)和骨髓重建的新骨生成。與cmRNA組相比，rhBMP-2組骨痂體積更大，皮質(zhì)的修復(fù)卻不明顯，提示了cmRNA應(yīng)用的安全性更好。cmRNA在較低濃度時能夠增強X型膠原的表達，并刺激間充質(zhì)前體的軟骨形成，但無法進一步促進軟骨內(nèi)成骨。加大劑量到50ug后促進軟骨內(nèi)成骨繼續(xù)到骨形成。cmRNA處理后TRAP陽性面積比顯著增加，局部IL-17A和RANKL表達增加，表明與rhBMP-2相比，cmRNA治療組織重塑效果更好。

Figure 4. BMP-2 cmRNA administration induces de novo bone deposition in the defect.

05

研究者又通過免疫組化發(fā)現(xiàn)經(jīng)cmRNA治療骨缺損中存在II型和X型膠原。這些膠原的表達在低劑量cmRNA治療的骨缺損組別中最高。而II型膠原在50ug cmRNA治療后期的缺損中已不可見，推測是因為足量cmRNA加快軟骨內(nèi)骨化修復(fù)。低劑量應(yīng)用cmRNA治療后X型膠原的表達弱于II型膠原，無法繼續(xù)促進軟骨內(nèi)骨化。經(jīng)50ug cmRNA處理的缺損在4周時X型膠原已不明顯，證明足量的cmRNA治療產(chǎn)生的II型和X型膠原能夠加快修復(fù)進程。
 

Figure 5. Collagen type II deposition and chondrocytic cells are only visible within defects administered BMP-2 cmRNA,Collagen type X is clearly visible 4 weeks after BMP-2 cmRNA treatment but decreases at 8 weeks.

06

為了評估骨缺損治療中局部炎癥因子產(chǎn)生情況，研究者在手術(shù)和應(yīng)用cmRNA或rhBMP-2后的不同時間，測定外周血中各種炎癥因子、腫瘤壞死因子及抗炎因子的濃度。模型組和rhBMP-2治療組沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子的增加。而在cmRNA治療組中，細(xì)胞因子水平顯著升高。單獨使用非編碼cmRNA會增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生。當(dāng)使用目的基因的cmRNA時，誘導(dǎo)炎癥作用進一步增強。其中對促炎細(xì)胞因子IL-1a的誘導(dǎo)作用特別強。而對照cmRNA組誘導(dǎo)炎癥的水平在第1天較低，所有組別細(xì)胞因子升高均在術(shù)后1天達到峰值，并持續(xù)至少10天。

Figure 6. Circulating cytokines elevated as a result of cmRNA application.

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