應(yīng)用場(chǎng)景1：結(jié)構(gòu)分子招募核心蛋白與核酸
適用范圍：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)等任意研究方向
lncRNA和circRNA有時(shí)候會(huì)作為一種特殊的RNA分子，形成蛋白-蛋白復(fù)合物或蛋白-核酸的骨架分子，對(duì)下游分子行使一系列調(diào)控作用。如部分circRNA會(huì)招募一些泛素化酶對(duì)下游的蛋白行使降解功能，或者部分lncRNA會(huì)招募一些轉(zhuǎn)錄因子與目的基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合激活下游的基因表達(dá)等。
應(yīng)用場(chǎng)景2：外泌體
適用范圍：臨床與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等任意研究方向
lncRNA在外泌體中由于以碎片形式存在，這種隨機(jī)片段不僅不利于檢測(cè)，而且較低的濃度和較差的重復(fù)性，使得lncRNA并不是外泌體研究的熱門分子之一。但是circRNA由于其穩(wěn)定性，除了從體液樣本外泌體中分離circRNA可作為疾病標(biāo)志物外，還能用于后期的外泌體治療等領(lǐng)域，是后ceRNA時(shí)代中較為熱門的circRNA細(xì)分研究領(lǐng)域方向之一。其中一個(gè)方向是疾病標(biāo)志物，一般以大樣本隊(duì)列研究居多。一種是后期轉(zhuǎn)化及機(jī)制研究方向，包括外泌體受體細(xì)胞分子機(jī)制研究以及疾病治療等方向。
應(yīng)用場(chǎng)景3：翻譯多肽
適用范圍：臨床與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)等任意研究方向
circRNA上有一段未翻譯的RNA序列，稱為IRES，它可以折疊成類似于起始tRNA的結(jié)構(gòu)，并招募更多的核糖體。正常情況下，IRES不與eIF結(jié)合，而是與一類稱為ITAF的蛋白質(zhì)結(jié)合。ITAF的作用是將核糖體募集到circRNA的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，以啟動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯。此外，還可能存在IRES增強(qiáng)子，類似于circ-ZNF609的UTR元件。也有研究通過(guò)翻譯組測(cè)序與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了非編碼RNA LINC-PINT形成環(huán)狀RNA后可被翻譯形成功能多肽。
應(yīng)用場(chǎng)景4：ceRNA調(diào)控機(jī)制
ceRNA全稱competing endogenous RNA，是一種能夠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RNA的作用元件。通常lncRNA和circRNA會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA，九游會(huì)j9一般把lncRNA和circRNA可以稱作ceRNA。ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)全稱ceRNAregulation network，指的是有ceRNA參與的整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)cascade。而ceRNA分析指的是對(duì)整個(gè)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。一般有circRNA-miRNA-mRNA分析或lncRNA-miRNA-mRNA分析。
案例展示
circRNA和母基因通過(guò)不同的pathway影響肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，遷移和侵襲
1.研究背景
肝細(xì)胞癌（HCC）是最常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，同時(shí)，中國(guó)也是肝癌的癌癥大國(guó)。雖然現(xiàn)在的醫(yī)療診斷技術(shù)發(fā)展很快，但是，對(duì)與肝癌的現(xiàn)有診斷技術(shù)還是受限很大。因此，開(kāi)發(fā)新的診斷biomarker，并理解這些biomarker的作用機(jī)制，是很多科研人員想做的事情。本研究從circRNA，一類非常適合做biomarker的候選分子出發(fā)，深入研究了一個(gè)鋅指家族基因ZKSCAN1及其產(chǎn)生的circZKSCAN1，在HCC中的作用機(jī)制及作為biomarker的潛在價(jià)值。
2.研究結(jié)果
1)基因表達(dá)模式分析
ZKSCAN1，是一個(gè)鋅指蛋白家族，該家族基因在腫瘤發(fā)生，發(fā)展，轉(zhuǎn)移和藥物耐受方面都發(fā)揮著非常重要的作用。同時(shí)，現(xiàn)有的研究也發(fā)現(xiàn)，ZKSCAN1基因的第二個(gè)和第三個(gè)外顯子部分能形成一個(gè)circRNA，在人腦部和肝臟表達(dá)豐富。因此，研究人員首先驗(yàn)證了ZKSCAN1和circ ZKSCAN1在HCC組織中的表達(dá)情況。102個(gè)HCC組織和配對(duì)癌旁的RT-PCR結(jié)果顯示，他們?cè)贖CC樣本中的表達(dá)顯著降低。進(jìn)一步將ZKSCAN1和circ ZKSCAN1的表達(dá)與臨床指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)低的ZKSCAN1表達(dá)與腫瘤大小顯著相關(guān)；而circ ZKSCAN1的表達(dá)與不同腫瘤數(shù)目，硬化程度，血管侵襲，微血管侵襲，腫瘤grade都顯著相關(guān)。ROC曲線分析顯示，circ ZKSCAN1的AUC值達(dá)到0.834，敏感性和特異性能達(dá)到82.2%和72.4%，相比而言，ZKSCAN1的AUC值只有0.474。因此，circ ZKSCAN1的表達(dá)更合適作為腫瘤組織的診斷biomarker。
2)circRNA與母基因表達(dá)相關(guān)性分析
對(duì)于circRNA的研究，第一個(gè)想到的是circRNA的表達(dá)是否會(huì)和母基因表達(dá)有關(guān)聯(lián)。因此，研究人員先在不同人HCC細(xì)胞系中檢測(cè)了ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)所有的細(xì)胞系（Huh7, SMMC-7721, BEL-7402, HepG2和HepG3B）相比對(duì)照組（L02），表達(dá)都降低。通過(guò)在HepG2和SMMC7721中過(guò)表達(dá)和敲降ZKSCAN1和circZKSCAN1，研究人員發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)或者敲降其中一個(gè)，不會(huì)影響另一個(gè)的表達(dá)變化。因此，ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的表達(dá)彼此獨(dú)立，不相互影響。
3)基因功能分析
為探究ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1對(duì)HCC細(xì)胞的功能影響，研究人員進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果顯示，在ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的敲降細(xì)胞中，增殖能力顯著增強(qiáng)，而過(guò)表達(dá)細(xì)胞中，顯著下降；過(guò)表達(dá)細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低；敲降細(xì)胞顯著增加。進(jìn)一步的裸鼠種植實(shí)驗(yàn)也表明，過(guò)表達(dá)時(shí)腫瘤生長(zhǎng)抑制，而敲降時(shí)刺激腫瘤生長(zhǎng)。因此，ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有顯著影響。
4)基因亞細(xì)胞定位
基因在細(xì)胞中的定位往往決定著他們的功能行使。因此，研究人員對(duì)ZKSCAN1的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，正常肝組織的細(xì)胞質(zhì)中存在大量的ZKSCAN1，而HCC肝組織中卻很少。另外，F(xiàn)ISH分析表明circ ZKSCAN1也是主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。
5)下游調(diào)控基因分析
為探究ZKSCAN1調(diào)控細(xì)胞增殖和侵襲的內(nèi)在分子機(jī)制。研究人員對(duì)敲降ZKSCAN1 mRNA和circ ZKSCAN1的HCC細(xì)胞與對(duì)照進(jìn)行了全基因組RNA測(cè)序。結(jié)果顯示，敲降circZKSCAN1引起372個(gè)基因差異表達(dá)；敲降ZKSCAN1引起346個(gè)基因差異表達(dá)。其中，兩組結(jié)果中共有166個(gè)是在兩種情況下都出現(xiàn)差異。KEGG通路分析顯示，敲降circ ZKSCAN1的差異基因富集到PI3K pathway, migration pathway, actin cytoskeleton pathway等；而敲降ZKSCAN1則主要富集到metabolic pathways。因此，circ ZKSCAN1和ZKSCAN1影響了下游不同的信號(hào)通路影響細(xì)胞增殖和侵襲。
6)qRT-PCR驗(yàn)證下游基因
最后，研究人員對(duì)特異性地在ZKSCAN1敲降后變化的基因與circZKSCAN1敲降后變化的基因及都變化的基因進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明，在ZKSCAN1敲降后，細(xì)胞代謝相關(guān)基因確實(shí)發(fā)生了顯著變化；而在circZKSCAN1敲降后，凋亡和遷移相關(guān)基因發(fā)生顯著變化；COL3A1，CDH5，MYB，PDK1和BCL2在兩種情況下都顯著變化。
研究結(jié)論
在本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)，雖然ZKSCAN1和circRNA在HCC中都發(fā)生了顯著下調(diào)，都是影響細(xì)胞生長(zhǎng)，遷移和侵襲，但是，他們影響的下游信號(hào)通路卻是各不相同。該研究為理解circRNA和其母基因在生命體中的調(diào)控作用提供了新的依據(jù)。
參考文獻(xiàn)
Yao Z, Luo J, Hu K，et al.（2017）ZKSCAN1 gene and its related circular RNA (circZKSCAN1) both inhibit hepatocellular carcinomacell growth, migration and invasion but through different signaling pathways. Mol Oncol. doi: 10.1002/1878-0261.12045
結(jié)果展示
1.基因表達(dá)值密度
不同樣本各自表達(dá)量處理后數(shù)值log10（fpkm）做表達(dá)值密度圖，可以比較不同樣本間表達(dá)趨勢(shì)的變化。理想狀態(tài)下，各樣本的表達(dá)密度圖應(yīng)符合正態(tài)分布，同時(shí)生物學(xué)重復(fù)樣本的表達(dá)趨勢(shì)應(yīng)趨于一致。
2.差異circRNA-hosting gene GO富集性柱狀圖
GO富集性分析結(jié)果柱狀圖反映在生物過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組分 (cellularcomponent)和分子功能(molecular function)富集的GO term上差異基因的個(gè)數(shù)分布情況。
3.差異circRNA-hosting gene KEGG富集性散點(diǎn)圖
通過(guò)ggplot2對(duì)KEGG富集分析結(jié)果以散點(diǎn)圖的形化進(jìn)行展示，其中橫坐標(biāo)Rich factor表示位于該KEGG的差異基因個(gè)數(shù)/位于該KEGG的總基因數(shù)（Rich factor=S gene number/B gene number），Rich factor越大，KEGG富集程度 越高?？v坐標(biāo)是Pathway term，即KEGG代謝通路。散點(diǎn)圖中，點(diǎn)的大小代表 S gene number 匹配到單個(gè)KEGG的具有顯著性差異的基因數(shù)，點(diǎn)的顏色代表 富集分析的p值，即富集的顯著性。KEGG富集分析散點(diǎn)圖是根據(jù)富集的顯著 性（pvalue）取top20的Pathway term進(jìn)行繪圖。
常見(jiàn)問(wèn)題
