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非編碼RNA（Non-coding RNA）是指不編碼蛋白質的RNA，包括miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA等。非編碼RNA發(fā)揮功能的方式很多，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種細胞活動，主要包括基因的激活和沉默，RNA的剪接、修飾和編輯，蛋白質的翻譯等。
1.miRNA：miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動植物中參與轉錄后基因表達調控。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNA也可以調節(jié)同一個基因。
圖一 miRNA成熟及作用方式（Mikhailidis DP, Athyros VG. Nat Rev Cardiol. 2014 Feb;11(2):72-4.）
miRNA過表達：將miRNA前體序列構建入病毒載體中，該載體既可用于瞬時轉染細胞，也可以包裝成病毒用于穩(wěn)定株篩選和動物水平過表達miRNA。
miRNA敲低：設計針對miRNA的TuD RNA封閉片段或海綿片段，再將該片段構建入病毒載體中。該載體除了可以直接瞬時轉染細胞用于miRNA的敲低，也可以包裝成慢病毒，用于動物水平敲低miRNA。
miRNA靶基因預測：miRNA通過堿基互補配對的方式識別靶基因的3’UTR區(qū)，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。因此，可以將目的基因的3’UTR區(qū)域構建到含luciferase的報告基因上，通過比較miRNA過表達或inhibitor 與報告基因作用檢測熒光值的變化，判斷miRNA對靶基因的作用。再通過對3’UTR區(qū)進行定點突變的方法進一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。
miRNA常用數(shù)據庫：
（1）miRbase（http://www.mirbase.org）：miRbase 是由曼徹斯特大學的研究人員開發(fā)的一個在線的miRNA數(shù)據庫，提供包括已發(fā)表的miRNA序列數(shù)據、注釋、預測基因靶標等信息的全方位數(shù)據庫，是存儲miRNA信息最主要的公共數(shù)據庫之一。
。2）TargetScan（http://www.targetscan.org/）：TargetScan是通過搜索和每條miRNA種子區(qū)域匹配的保守的8mer和7mer位點來預測靶基因。
。3）TarBase（http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8%2Findex）：TarBase數(shù)據庫人工經歷了長達10年左右的時間去搜集了實驗驗證過的miRNA的靶基因，包括在人、小鼠、果蠅、蠕蟲和斑馬魚中的miRNA的靶基因。
。4）miRWalk（http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/）：miRWalkis是一個綜合性數(shù)據庫，提供來自人類、小鼠和大鼠的miRNA的預測信息和經過驗證的位于其靶基因上的結位點。
2.lncRNA：lncRNA是長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA）的簡稱，是長度在200-100000 nt之間的RNA分子。大多數(shù)的lncRNAs在組織分化發(fā)育過程中，都具有明顯的時空表達特異性；序列上保守性較低，只有約12%的lncRNA可在人類之外的其它生物中找到。
根據lncRNA在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置，可以將其分為啟動子區(qū)（promoter associated）、內含子間（intronic）、雙向（bidirectional）、正義鏈（sense）、反義鏈（antisense）、3’UTR區(qū)（3’UTR associated）、基因間（intergenic）這7種類型。這種位置關系對于推測lncRNA的功能有很大幫助。
圖二 lncRNA分類（Huang X, et al.Cancer Lett. 2018 Jan 28;413:94-101.）
一般來說，lncRNA主要從以下三種層面實現(xiàn)對基因表達的調控：
。1）表觀遺傳學調控：lncRNA招募染色質重構復合體到特定位點進而介導相關基因的表達沉默。
。2）轉錄調控：包括如下幾種：1）lncRNA的轉錄能夠干擾臨近基因的表達；2）lncRNA能夠通過封阻啟動子區(qū)域來干擾基因的表達；3）lncRNA能夠與RNA結合蛋白作用，并將其定位到基因啟動子區(qū)從而調控基因的表達；4）lncRNA能夠調節(jié)轉錄因子的活性；5）lncRNA也能夠通過調節(jié)基本轉錄因子來實現(xiàn)調控基因的表達。
。3）轉錄后調控：lncRNA能夠在轉錄后水平通過與mRNA形成雙鏈的形式調控基因的表達。
lncRNA過表達：將lncRNA序列構建入病毒載體中，該載體既可用于瞬時轉染細胞，也可以包裝成病毒用于穩(wěn)定株篩選和動物水平過表達lncRNA。
lncRNA干擾：針對lncRNA設計干擾片段，再將該片段構建入病毒載體中。該載體除了可以直接瞬時轉染細胞用于lncRNA的干擾，也可以包裝成慢病毒，用于動物水平干擾lncRNA。
lncRNA敲除：用CRISPR/Cas9技術對lncRNA進行敲除。針對lncRNA某條片段的兩端分別設計多條sgRNA序列，實現(xiàn)大片段刪除，從而達到敲除的效果。將sgRNA序列構建入病毒載體中，再將Cas9序列裝入另一載體中，隨后兩種病毒同時感染目的細胞進行敲除。
lncRNA靶基因尋找：方法基本類似于上面表述的miRNA雙熒光素酶檢測。
3.circRNA: circRNA即環(huán)形RNA（circular RNA）的簡稱，是一類不具有5’末端帽子和3’ 末端poly（A）尾巴、并以共價鍵形成環(huán)形結構的客觀存在于生物體內的非編碼RNA分子。
circRNA主要特征：
?。?）circRNA由特殊可變剪切產生，大量存在與真核細胞的細胞質中，主要來源于外顯子，少部分內含子來源的circRNA存在細胞核中。
。2）表達水平具有種屬、組織、時間特異性。
（3）circRNA呈閉合環(huán)狀結構，不易被核酸外切酶降解，比線性RNA更加穩(wěn)定。
。4）具有一定序列保守性。
。5）在轉錄或轉錄后水平發(fā)揮調控作用。
。6）絕大多數(shù)circRNA是非編碼的，但也有少數(shù)可以翻譯為多肽。
circRNA根據其來源可分為三類：外顯子來源的circRNA（exonic circRNAs），內含子來源的circRNA（circular intronic RNAs，ciRNAs），以及由外顯子和內含子共同組成的circRNA（retained-intron circRNAs）。
circRNA的作用機制：
miRNA分子海綿，circRNA含有大量的miRNA結合位點，具有miRNA海綿作用，進而間接調控miRNA下游靶基因的表達。
調控基因轉錄，circRNA也可以通過與RNA結合蛋白的結合來調控蛋白功能，比如通過與轉錄因子的結合來抑制基因的轉錄。
編碼功能，circRNA雖然屬于非編碼RNA，但是也有少數(shù)circRNA可以編碼多肽，通過該多肽行使調控功能。
circRNA過表達：同上述的lncRNA步驟類似，但是circRNA過表達由于成環(huán)效率的影響，其難度相對普通基因的過表達更大。
circRNA干擾：同上述的lncRNA方法步驟。
circRNA敲除：同上述的lncRNA方法步驟。
circRNA靶基因尋找：同上述的miRNA和lncRNA雙熒光素酶檢測方法。
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服務內容 |
服務形式一 |
服務形式二 |
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miRNA過表達 |
質粒構建 |
慢病毒/腺相關病毒/腺病毒 |
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miRNA干擾 |
質粒構建 |
慢病毒/腺相關病毒/腺病毒 |
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lncRNA過表達 |
質粒構建 |
慢病毒/腺相關病毒/腺病毒 |
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lncRNA干擾 |
質粒構建 |
慢病毒/腺相關病毒/腺病毒 |
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lncRNA敲除 |
質粒構建 |
慢病毒/腺相關病毒/腺病毒 |
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circRNA過表達 |
質粒構建 |
慢病毒/腺相關病毒/腺病毒 |
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circRNA干擾 |
質粒構建 |
慢病毒/腺相關病毒/腺病毒 |
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circRNA敲除 |
質粒構建 |
慢病毒/腺相關病毒/腺病毒 |
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雙熒光素酶實驗 |
質粒構建 |
整套外包服務 |
