全國服務(wù)熱線400-151-5198 業(yè)務(wù)咨詢15800353038
外泌體（Exosomes）是細(xì)胞分泌到胞外的一種囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），其大小為30-150nm，具有雙層膜結(jié)構(gòu)和茶托狀形態(tài)，含有豐富的內(nèi)含物（包括核酸、蛋白和脂質(zhì)等），參與細(xì)胞間的分子傳遞。外泌體廣泛存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及各種體液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等，同時也存在于組織樣本中，如腦組織、肌肉組織、脂肪組織等。
腦組織分離方法簡述：將腦組織剪成薄片，放入離心管中加上消化液進行消化，經(jīng)水浴、反復(fù)輕輕上下顛倒，再用移液槍間斷緩慢吹吸至消化結(jié)束。隨后加入培養(yǎng)基于消化液中，混勻，置于冰上。再進行一系列的差速超速離心過程，包括除雜、濾膜過濾、超離等。最后用PBS重懸外泌體，用重懸后的外泌體進行下面的透射電鏡（TEM）、納米粒徑跟蹤分子（NTA）和marker WB鑒定。
圖一 胞外囊泡分泌
所有的細(xì)胞都能分泌外泌體，但是不同細(xì)胞分泌的外泌體不管在數(shù)量上還是在內(nèi)含物中都具有很大的差異性，這也決定了每種外泌體所行使的功能不一樣。外泌體廣泛參與細(xì)胞間物質(zhì)運輸與信息傳遞，調(diào)控細(xì)胞生理活動。同時，外泌體具有抗原提呈、免疫逃逸、誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化、促進腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等作用；此外，外泌體還可以作為“天然的納米粒子”來進行藥物遞送。
外泌體相關(guān)數(shù)據(jù)庫有哪些？
l exoRBase數(shù)據(jù)庫收集和描述人類血液外泌體中所有長的RNA，包括circRNA、lncRNA和mRNA。
l EVpedia和Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫匯總了不同囊泡研究中發(fā)現(xiàn)的蛋白、mRNA、miRNA、脂類等信息。
l ExoCarta數(shù)據(jù)庫主要收錄了包括人、大鼠、小鼠、綿羊等幾個物種的286個研究結(jié)果，涉及蛋白、mRNA、miRNA、脂類等信息。
樣本預(yù)處理與外泌體分離、保存：
外泌體存在于人類或動物的各種體液中，九游會j9可以選擇不同的樣本來源進行相關(guān)的外泌體研究。由于外泌體是來源于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷的含有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)的多泡小體，分布于胞外基質(zhì)。為了獲得高純度的外泌體，必須確保有效去除所有的細(xì)胞碎片及其他不需要的雜質(zhì)。
1） 細(xì)胞培養(yǎng)上清 2）血漿/血清
3）尿液 4）腦脊液
5）卵泡液 6）宮腔液
7）膽汁 8）羊水
9）腹水 10）胸腔液
不同的實驗樣本采集時需要注意的地方不一樣，如細(xì)胞培養(yǎng)上清在收集樣本前需換成無外泌體血清培養(yǎng)、血漿樣本采集時用一定不能用肝素抗凝管、尿液收集時需要加抑菌劑等。
從生物體液中分離外泌體的各種方法已經(jīng)被開發(fā)出來，主要根據(jù)外泌體的大小、密度、免疫特性等特點進行操作。分離出高純度的外泌體是九游會j9后續(xù)開展外泌體研究的關(guān)鍵步驟，目前差速超速離心是外泌體分離方法中公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，也是高分文章中首選的分離方法。
外泌體提取在短時間（一周之內(nèi)）使用，可以放在4度保存，如果長時間保存可以放在-20度或-80度保存。也可以將外泌體進行分裝，分別放在-20度或-80度。
外泌體檢測方法：
外泌體分離之后，需要經(jīng)過一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。鑒定方法從物理特征到表面分子標(biāo)志物，多角度進行鑒定。
l 透射電鏡鑒定法：簡稱TEM，適合外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀察，即通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形。
圖二 透射電鏡
l 納米顆粒跟蹤分析法：簡稱NTA，該方法能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度快，檢測后能提供外泌體粒徑和濃度信息。
圖三 NTA
l Western blot分子標(biāo)志物檢測：外泌體標(biāo)志蛋白包括四跨膜蛋白家族，如CD9、CD63和CD81；細(xì)胞質(zhì)蛋白，如肌動蛋白（Actin）和鈣磷脂結(jié)合蛋白（Annexins）；參與生物功能的分子，如凋亡轉(zhuǎn)接基因2互作蛋白X（ALIX）、腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）、熱休克蛋白（HSP70、HSP90），以及細(xì)胞分泌的特異性蛋白。
圖四 Western Blot（Tian Su et al., ACS Nano. 2019）
外泌體高通量檢測
外泌體內(nèi)含有與細(xì)胞來源相關(guān)的蛋白質(zhì)和核酸，可以運輸?shù)鞍踪|(zhì)、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等進入受體細(xì)胞，參與細(xì)胞間通訊。不同細(xì)胞來源的外泌體所含有的蛋白成分和RNA不太相同，可作為多種疾病的早期診斷標(biāo)記物，也能作為靶向藥物的載體進行疾病治療。
1. miRNA高通量測序
2. mRNA高通量測序
3. lncRNA芯片（人、小鼠）
4. ceRNA芯片（人、小鼠）
5. 蛋白質(zhì)組分析（iTRAQ、TMT、Label-free）
外泌體標(biāo)記或示蹤：
l 親脂染料標(biāo)記外泌體：目前已發(fā)表的外泌體文章中，外泌體大多使用親脂性染料進行標(biāo)記，體內(nèi)和體外都有較多應(yīng)用。親脂性染料主要分為兩大類，第一類是PKH67（綠色熒光）/PKH26（紅色熒光），由于它們可以與外泌體的脂質(zhì)雙層膜穩(wěn)定結(jié)合，所以染色效果較好，應(yīng)用較廣泛。
圖五 PKH67標(biāo)記的外泌體與神經(jīng)元之間相互作用（Juan Carlos Polanco et al., Acta Neuropathol Commun. 2018）
圖六 PKH26標(biāo)記的外泌體與MDA‐MB‐231細(xì)胞共培養(yǎng)（Mengyu Yu et al., Cancer Sci. 2019）
第二類是Di系列的親脂性染料，包括DiI（橙色熒光）、DiO（綠色熒光）、DiD（紅色熒光）、DiR（深紅色熒光）。其中DiR的紅外熒光可穿透細(xì)胞和組織，在活體成像中用來示蹤。
圖七 DiI標(biāo)記的外泌體通過靜脈注射觀察在體內(nèi)器官的分布情況（Laura Otero-Ortega et al., J Cereb Blood Flow Metab. 2018）
l 慢病毒介導(dǎo)CD63-GFP表達：將外泌體的特定蛋白CD63和綠色熒光蛋白GFP的表達元件構(gòu)建成質(zhì)粒再包裝到慢病毒中，隨后用此慢病毒感染細(xì)胞，使細(xì)胞分泌的外泌體帶有綠色熒光。
圖八 用GFP標(biāo)記的外泌體分別與SH-SY5Y、BV2和DRG細(xì)胞共培養(yǎng)（Rui Ren et al., Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019）
圖九 注射有CD63-GFP的外泌體后觀察第1天(D1)和第5天(D2)的熒光（Rui Ren et al., Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019）
外泌體功能研究：
將標(biāo)記的外泌體加入受體細(xì)胞培養(yǎng)基中，與受體細(xì)胞進行共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的功能變化，如細(xì)胞增殖、遷移與侵襲、細(xì)胞凋亡等；或者將外泌體注射入動物模型中，觀察動物表型變化和檢測動物相關(guān)指標(biāo)。
圖十 DiR標(biāo)記的外泌體靜脈注射小鼠結(jié)腸癌腫瘤模型（Gaofeng Liang et al., J Nanobiotechnology. 2020）
圖十一 外泌體的功能研究（Tian Fang et al., Nat Commun. 2018）
九游會j9的優(yōu)勢：
1) 實驗周期短；
2) 價格優(yōu)惠；
3) 完善的售后服務(wù)；
4) 項目經(jīng)驗豐富，成功率幾乎100%；
5) 完整的一套實驗服務(wù)。
九游會j9提供的服務(wù)：
1) 差速超速離心分離；
2) 透射電鏡拍攝（TEM）；
3) 納米粒徑跟蹤分析（NTA）；
4) Western Blot檢測蛋白標(biāo)志物；
5) 外泌體高通量測序/芯片；
6) 外泌體標(biāo)記或示蹤；
7) 外泌體細(xì)胞功能檢測；
8) 外泌體動物注射；
9) 外泌體動物模型驗證等。
