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CRlSPR/Cas9是細(xì)菌和古生物菌用來抵抗外來質(zhì)粒或噬菌體等遺傳物質(zhì)入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)。利用CRlSPR/Cas9技術(shù)建立哺乳動(dòng)物全基因組突變庫或者與某類功能相關(guān)的基因突變體庫，通過功能性篩選和富集以及隨后的PCR擴(kuò)增和深度測序分析，發(fā)掘與篩選表型相關(guān)的基因，稱為CRlSPR/Cas9 gRNA文庫篩選。gRNA文庫是藥物篩選或靶向篩選特定通路的理想工具，gRNA文庫的建立將在功能基因篩選、疾病機(jī)制研究及藥物研發(fā)等方面發(fā)揮重要的功能。
CRlSPR/Cas9 gRNA文庫篩選流程分為五步，即gRNA文庫選擇、gRNA文庫擴(kuò)增、gRNA文庫慢病毒包裝、gRNA文庫篩選、PCR擴(kuò)增和NGS測序
1、gRNA文庫選擇
首先客戶選擇所需gRNA文庫。如果客戶根據(jù)具體需要提出文庫定制（小于300個(gè)基因），九游會(huì)j9將根據(jù)客戶提供的基因群信息進(jìn)行單個(gè)基因的gRNA設(shè)計(jì)，保證每個(gè)基因設(shè)計(jì)3個(gè)不同的gRNA，最大程度確保基因功能的突變。九游會(huì)j9采用的載體是單/雙慢病毒載體，單慢病毒載體是一個(gè)載體上同時(shí)攜帶單個(gè)gRNA和cas9基因，雙慢病毒載體是一個(gè)載體上只有單個(gè)gRNA，cas9蛋白則由單獨(dú)攜帶cas9的載體提供。這兩種模式載體均攜帶有額外的抗性篩選標(biāo)記。
2、gRNA文庫擴(kuò)增
上述構(gòu)建的載體數(shù)量較少，不足以進(jìn)行文庫的慢病毒包裝和使用。因此，需要對上述載體進(jìn)行擴(kuò)增，增加總量。上述gRNA載體構(gòu)建完成后，九游會(huì)j9將這些載體按相同的比例混合成一個(gè)pool（即載體混合庫），隨后將載體混合庫使用專用電轉(zhuǎn)感受態(tài)，電轉(zhuǎn)擴(kuò)增培養(yǎng)并收集菌落，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，最后抽提質(zhì)粒，即得到了擴(kuò)增后的載體混合庫，也就是文庫。
3、gRNA文庫慢病毒包裝
擴(kuò)增后的gRNA文庫在慢病毒包裝載體的輔助下轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒的包裝。由于gRNA文庫是由多個(gè)不同的gRNA載體混合而成，因此九游會(huì)j9獲得的慢病毒是混合型病毒庫，每個(gè)病毒攜帶單個(gè)gRNA載體。
4、gRNA文庫篩選
對篩選的目的細(xì)胞進(jìn)行病毒感染預(yù)實(shí)驗(yàn)，得到細(xì)胞在較低的MOI時(shí)感染百分?jǐn)?shù)，以確認(rèn)感染時(shí)gRNA文庫的病毒用量。慢病毒庫以較低的MOI值感染細(xì)胞（確保每個(gè)細(xì)胞最多進(jìn)入一個(gè)慢病毒），隨后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩鴮?xì)胞采用相應(yīng)的處理，最后經(jīng)過不同的篩選方式富集細(xì)胞。以耐藥性基因篩選實(shí)驗(yàn)為例，根據(jù)前期藥物IC50實(shí)驗(yàn)，得到藥物篩選實(shí)驗(yàn)的處理濃度。采用高濃度藥物處理感染后的細(xì)胞，經(jīng)過篩選后存活的細(xì)胞則具有一定的耐藥性，將此群細(xì)胞擴(kuò)增并收集下來，耐藥性的來源是CRlSPR/Cas9 gRNA對相應(yīng)基因的修飾。
5、PCR擴(kuò)增和NGS測序
對步驟4篩選中富集下來的細(xì)胞進(jìn)行慢病毒載體的PCR擴(kuò)增，該擴(kuò)增片段包含載體所攜帶的gRNA序列，通過后續(xù)的NGS測序，九游會(huì)j9可以得到富集細(xì)胞中g(shù)RNA的富集度，從而尋找到相應(yīng)的基因，這些基因很有可能參與藥物作用過程，因此可作為深入研究的待選基因。
實(shí)驗(yàn)流程如下：
gRNA文庫類型：
|
文庫類型 |
物種 |
覆蓋基因 |
gRNAs/基因 |
載體類型 |
|
敲除全庫 |
人 |
全基因組覆蓋19050 Genes + 1864 miRNAs |
6條gRNAs |
慢病毒單載體 |
|
敲除全庫 |
小鼠 |
全基因組覆蓋20611 Genes +1175 miRNAs |
6條gRNAs |
慢病毒單載體 |
|
敲除全庫 |
人 |
全基因組覆蓋19050 Genes + 1864 miRNAs |
6條gRNAs |
慢病毒雙載體 |
|
敲除全庫 |
小鼠 |
全基因組覆蓋20611 Genes +1175 miRNAs |
6條gRNAs |
慢病毒雙載體 |
|
未知功能基因敲除文庫 |
人 |
1880個(gè)未知功能基因 |
10條gRNAs |
慢病毒雙載體 |
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激酶敲除文庫 |
人 |
507 Genes |
10條gRNAs |
慢病毒雙載體 |
|
激活文庫 |
人 |
23430 Genes |
3條gRNAs |
慢病毒雙載體 |
|
激活文庫 |
小鼠 |
23439 Genes |
3條gRNAs |
慢病毒三載體 |
|
敲低文庫 |
人 HFF |
4103 lncRNAs |
6條gRNAs |
慢病毒雙載體 |
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定制庫 |
至少300條gRNAs |
慢病毒單/雙載體 |
其中定制gRNA文庫，可根據(jù)通路中特定基因設(shè)計(jì)gRNA：
1)疾病相關(guān)基因：抑癌基因、原癌基因、糖尿病基因、心血管疾病基因、帕金森病基因等；
2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：RAS信號(hào)通路、WNT信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等；
3)細(xì)胞功能相關(guān)：自噬、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、血管新生、腫瘤抑制等。
gRNA文庫篩選表型：
1)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因篩。ㄌ迥諫稈。
2)細(xì)胞遷移/侵襲相關(guān)基因篩。ㄌ逋饃稈。
3)細(xì)胞克隆形成相關(guān)基因篩。ㄌ逋饃稈。
4)細(xì)胞增殖相關(guān)基因篩。ㄌ逋饃稈。
5)腫瘤耐藥相關(guān)基因篩。ㄌ逋饃稈。
6)細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)基因篩。ㄌ逋饃稈。
7)其他功能基因篩。繾允、細(xì)胞分化等
gRNA文庫應(yīng)用領(lǐng)域：
1)探索藥物作用機(jī)制：藥物靶點(diǎn)確定與驗(yàn)證
2)尋找腫瘤治療靶點(diǎn)：基因環(huán)路上下游調(diào)控機(jī)制分析
3)探究代謝疾病治療機(jī)制：代謝通路調(diào)節(jié)機(jī)制分析
九游會(huì)j9的優(yōu)勢：
1)產(chǎn)品全面：不僅擁有人類和小鼠的全基因組gRNA現(xiàn)貨文庫，而且可以定制任何類型的特定文庫，后期更有活性文庫即將推出！
2)價(jià)格劃算：現(xiàn)在訂購gRNA文庫享有一定折扣優(yōu)惠，讓您的實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)、快速和高效地進(jìn)行。
3)種類多樣：九游會(huì)j9不僅可以使用單克隆形式構(gòu)建sgRNA載體，也可以使用芯片形式合成，確保最大的覆蓋率。
4)服務(wù)到位：九游會(huì)j9除了可以提供gRNA文庫質(zhì)粒和病毒以外，還可以幫您進(jìn)行下一步的篩選，最終提供目標(biāo)基因名稱。
九游會(huì)j9提供的服務(wù)：
1)質(zhì)粒構(gòu)建：根據(jù)客戶需求構(gòu)建定制的gRNA文庫質(zhì)粒。
2)病毒包裝：將全庫質(zhì)?；蚨ㄖ瀑|(zhì)粒包裝成慢病毒，感染細(xì)胞。
2)篩選服務(wù)：客戶提供篩選方案，可以為客戶提供篩選服務(wù)。
