對(duì)組織或細(xì)胞在某一時(shí)刻或處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA進(jìn)行測(cè)序分析，全轉(zhuǎn)錄組的研究中包含對(duì)mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA進(jìn)行分析，并結(jié)合多種RNA信息探索彼此之間潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
樣本起始量與送樣建議
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樣本類型 |
起始量 |
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動(dòng)物及臨床臟器組織/腦組織等 |
>20mg |
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動(dòng)物及臨床皮膚/骨/血管/脂肪組織等 |
>100mg |
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植物葉片組織/花 |
>200mg |
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植物根/莖/果實(shí)/種子 |
>500mg |
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原代細(xì)胞/細(xì)胞系 |
>5×106個(gè) |
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中性粒細(xì)胞/嗜酸性粒細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞 |
>5×107個(gè) |
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外泌體樣本 |
>1×108個(gè) |
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血清/血漿/腦脊液/關(guān)節(jié)積液/卵泡液 |
>2mL |
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細(xì)胞培養(yǎng)上清液 |
>20mL |
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尿液 |
>30mL |
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總RNA |
>1μg且RIN>7.0 |
注意事項(xiàng)：
① 組織樣本建議保存在RNAlater、RNAHold、RNAProtect等相關(guān)組織保存液中，然后-80℃保存或干冰寄送；
② 細(xì)胞樣本使用TRIzol等裂解液充分裂解之后，-80℃保存或干冰寄送；
③ 更加詳細(xì)的樣本準(zhǔn)備指南，請(qǐng)聯(lián)系在線客服。
應(yīng)用場(chǎng)景
應(yīng)用場(chǎng)景1：結(jié)構(gòu)分子招募核心蛋白與核酸
適用范圍：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)等任意研究方向
lncRNA和circRNA有時(shí)候會(huì)作為一種特殊的RNA分子，形成蛋白-蛋白復(fù)合物或蛋白-核酸的骨架分子，對(duì)下游分子行使一系列調(diào)控作用。如部分circRNA會(huì)招募一些泛素化酶對(duì)下游的蛋白行使降解功能，或者部分lncRNA會(huì)招募一些轉(zhuǎn)錄因子與目的基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合激活下游的基因表達(dá)等。
應(yīng)用場(chǎng)景2：外泌體
適用范圍：臨床與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等任意研究方向
lncRNA在外泌體中由于以碎片形式存在，這種隨機(jī)片段不僅不利于檢測(cè)，而且較低的濃度和較差的重復(fù)性，使得lncRNA并不是外泌體研究的熱門分子之一。但是circRNA由于其穩(wěn)定性，除了從體液樣本外泌體中分離circRNA可作為疾病標(biāo)志物外，還能用于后期的外泌體治療等領(lǐng)域，是后ceRNA時(shí)代中較為熱門的circRNA細(xì)分研究領(lǐng)域方向之一。其中一個(gè)方向是疾病標(biāo)志物，一般以大樣本隊(duì)列研究居多。一種是后期轉(zhuǎn)化及機(jī)制研究方向，包括外泌體受體細(xì)胞分子機(jī)制研究以及疾病治療等方向。
應(yīng)用場(chǎng)景3：翻譯多肽
適用范圍：臨床與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)等任意研究方向
circRNA上有一段未翻譯的RNA序列，稱為IRES，它可以折疊成類似于起始tRNA的結(jié)構(gòu)，并招募更多的核糖體。正常情況下，IRES不與eIF結(jié)合，而是與一類稱為ITAF的蛋白質(zhì)結(jié)合。ITAF的作用是將核糖體募集到circRNA的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，以啟動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯。此外，還可能存在IRES增強(qiáng)子，類似于circ-ZNF609的UTR元件。也有研究通過翻譯組測(cè)序與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了非編碼RNA LINC-PINT形成環(huán)狀RNA后可被翻譯形成功能多肽。
應(yīng)用場(chǎng)景4：ceRNA調(diào)控機(jī)制
ceRNA全稱competing endogenous RNA，是一種能夠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RNA的作用元件。通常lncRNA和circRNA會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA，九游會(huì)j9一般把lncRNA和circRNA可以稱作ceRNA。ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)全稱ceRNA regulation network，指的是有ceRNA參與的整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)cascade。而ceRNA分析指的是對(duì)整個(gè)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。一般有circRNA-miRNA-mRNA分析或lncRNA-miRNA-mRNA分析。
案例展示
circular RNA(HRCR)靶標(biāo)結(jié)合miR-223保護(hù)心臟免受心肌肥厚和心臟衰竭
本研究中作者首先通過miRNA基因芯片分析、Northern blot、RT-PCR等技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)，ISO處理14天后，miRNA-223的表達(dá)量顯著上調(diào)，并且在患有心臟肥厚和心臟衰竭的人和小鼠心臟中miRNA-223的表達(dá)量也有明顯的上調(diào)，初步得出結(jié)論：miRNA-223參與調(diào)控心肌肥厚和心臟衰竭。接下來作者利用miR-223過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠以及miR-223基因敲除轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)一步驗(yàn)證表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223過表達(dá)小鼠成年后出現(xiàn)明顯的心肌肥厚和心臟衰竭癥狀，而miR-223基因敲除小鼠表型相反，進(jìn)一步證明在活體內(nèi)，miR-223可以誘導(dǎo)心肌肥厚和心臟衰竭。
接下來作者進(jìn)一步研究miR-223對(duì)心肌細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223過表達(dá)細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的心肌肥大反應(yīng)，而miR-223敲除細(xì)胞中，ISO處理引起的心肌肥大反應(yīng)明顯被破壞，說明miR-223過表達(dá)會(huì)促進(jìn)心肌肥厚，而miR-223基因敲除會(huì)阻斷心肌肥厚。
為了進(jìn)一步研究miR-223調(diào)控心肌肥厚和心臟衰竭的分子機(jī)制，作者篩選了一些參與調(diào)控心肌肥厚的基因作為miR-223的靶標(biāo)候選基因，然后通過western blot分析miR-223過表達(dá)和缺失突變體中上調(diào)以及下調(diào)的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223可以顯著抑制ARC的表達(dá)，而前人已經(jīng)有研究報(bào)道ARC參與調(diào)控心肌肥厚和細(xì)胞凋亡，所以初步推斷ARC可能是miR-223下游的靶標(biāo)位點(diǎn)。
CircRNA和miRNA的互作是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)話題，為了進(jìn)一步研究是否有CircRNA參與調(diào)控miR-223的表達(dá)，作者從CircRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)篩選出100個(gè)CircRNA，通過qRT-PCR驗(yàn)證篩選到36個(gè)CircRNA，然后通過Northern blot篩選到一個(gè)特異性表達(dá)的CircRNA: mm9-circ-012559(HRCR)。
然后作者通過RNAhybrid分析發(fā)現(xiàn)HRCR包含6個(gè)CircRNA的靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)，初步表明HRCR可以和miR-223結(jié)合。接下來作者通過生物素標(biāo)記，qRT-PCR，Northern bolt，pull down assay、熒光原位雜交（FISH）等技術(shù)手段，從正向以及反向兩個(gè)角度分別驗(yàn)證HRCR和miR-223之間的互作關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223和HRCR在細(xì)胞質(zhì)中存在共定位現(xiàn)象，HRCR可以直接結(jié)合到miR-223上。
HRCR和miR-223存在互作，而miR-223可以通過調(diào)控下游ARC的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控心肌肥厚和心臟衰竭，為了進(jìn)一步研究HRCR對(duì)ARC表達(dá)的影響，作者構(gòu)建了HRCR過表達(dá)載體和基因敲除突變體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HRCR過表達(dá)載體中，ARC的表達(dá)量和活性顯著增加，HRCR敲除突變體中，ARC的表達(dá)量和活性顯著降低，并且HRCR可以消除miR-223對(duì)ARC表達(dá)的抑制作用，說明HRCR可以通過調(diào)控miR-223以及ARC的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控心肌肥厚。
參考文獻(xiàn)
Wang K, Long B, Liu F, et al. A circular RNA protects the heart from pathological hypertrophy and heart failure by targeting miR-223.[J]. European Heart Journal, 2016, 37(33):2602-2611.
常見問題
1.全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)槭裁葱枰獦?gòu)建兩個(gè)文庫(kù)
全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序需要構(gòu)建2個(gè)測(cè)序文庫(kù)，一個(gè)小RNA文庫(kù)和一個(gè)去除核糖體RNA的鏈特異性文庫(kù)，然后分別上機(jī)測(cè)序。小RNA長(zhǎng)度較短，一般小于50nt，采用測(cè)序策略為50SE。其他三類RNA序列一般大于200，通常在1000以上，最高可達(dá)幾萬，通過片段化構(gòu)建150PE測(cè)序文庫(kù)。最后小RNA文庫(kù)可以獲得miRNA序列信息，去核糖體的鏈特異性文庫(kù)可以獲得mRNA、lncRNA和circRNA的序列信息。
2.什么是ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（ceRNA networks）。
這些非編碼RNA如lncRNA和circRNA等會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA，導(dǎo)致miRNA調(diào)控的靶基因發(fā)生變化，最終體現(xiàn)在蛋白的表達(dá)水平上，而miRNA處于ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心地位。如下圖
