對組織或細胞在某一時刻或處理條件下轉錄出來的所有RNA進行測序分析，全轉錄組的研究中包含對mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA進行分析，并結合多種RNA信息探索彼此之間潛在的調控網絡。
樣本起始量與送樣建議
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樣本類型 |
起始量 |
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動物及臨床臟器組織/腦組織等 |
>20mg |
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動物及臨床皮膚/骨/血管/脂肪組織等 |
>100mg |
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植物葉片組織/花 |
>200mg |
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植物根/莖/果實/種子 |
>500mg |
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原代細胞/細胞系 |
>5×106個 |
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中性粒細胞/嗜酸性粒細胞/嗜堿性粒細胞 |
>5×107個 |
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外泌體樣本 |
>1×108個 |
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血清/血漿/腦脊液/關節(jié)積液/卵泡液 |
>2mL |
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細胞培養(yǎng)上清液 |
>20mL |
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尿液 |
>30mL |
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總RNA |
>1μg且RIN>7.0 |
注意事項：
① 組織樣本建議保存在RNAlater、RNAHold、RNAProtect等相關組織保存液中，然后-80℃保存或干冰寄送；
② 細胞樣本使用TRIzol等裂解液充分裂解之后，-80℃保存或干冰寄送；
③ 更加詳細的樣本準備指南，請聯(lián)系在線客服。
應用場景
應用場景1：結構分子招募核心蛋白與核酸
適用范圍：基礎醫(yī)學、生物化學與分子生物學等任意研究方向
lncRNA和circRNA有時候會作為一種特殊的RNA分子，形成蛋白-蛋白復合物或蛋白-核酸的骨架分子，對下游分子行使一系列調控作用。如部分circRNA會招募一些泛素化酶對下游的蛋白行使降解功能，或者部分lncRNA會招募一些轉錄因子與目的基因的啟動子區(qū)域結合激活下游的基因表達等。
應用場景2：外泌體
適用范圍：臨床與轉化醫(yī)學、基礎醫(yī)學等任意研究方向
lncRNA在外泌體中由于以碎片形式存在，這種隨機片段不僅不利于檢測，而且較低的濃度和較差的重復性，使得lncRNA并不是外泌體研究的熱門分子之一。但是circRNA由于其穩(wěn)定性，除了從體液樣本外泌體中分離circRNA可作為疾病標志物外，還能用于后期的外泌體治療等領域，是后ceRNA時代中較為熱門的circRNA細分研究領域方向之一。其中一個方向是疾病標志物，一般以大樣本隊列研究居多。一種是后期轉化及機制研究方向，包括外泌體受體細胞分子機制研究以及疾病治療等方向。
應用場景3：翻譯多肽
適用范圍：臨床與轉化醫(yī)學、基礎醫(yī)學、生物化學與分子生物學等任意研究方向
circRNA上有一段未翻譯的RNA序列，稱為IRES，它可以折疊成類似于起始tRNA的結構，并招募更多的核糖體。正常情況下，IRES不與eIF結合，而是與一類稱為ITAF的蛋白質結合。ITAF的作用是將核糖體募集到circRNA的內部結構，以啟動蛋白質翻譯。此外，還可能存在IRES增強子，類似于circ-ZNF609的UTR元件。也有研究通過翻譯組測序與轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)了非編碼RNA LINC-PINT形成環(huán)狀RNA后可被翻譯形成功能多肽。
應用場景4：ceRNA調控機制
ceRNA全稱competing endogenous RNA，是一種能夠競爭結合RNA的作用元件。通常lncRNA和circRNA會競爭結合miRNA，九游會j9一般把lncRNA和circRNA可以稱作ceRNA。ceRNA調控網絡全稱ceRNA regulation network，指的是有ceRNA參與的整個調控網絡cascade。而ceRNA分析指的是對整個ceRNA調控網絡進行分析。一般有circRNA-miRNA-mRNA分析或lncRNA-miRNA-mRNA分析。
案例展示
circular RNA(HRCR)靶標結合miR-223保護心臟免受心肌肥厚和心臟衰竭
本研究中作者首先通過miRNA基因芯片分析、Northern blot、RT-PCR等技術手段發(fā)現(xiàn)，ISO處理14天后，miRNA-223的表達量顯著上調，并且在患有心臟肥厚和心臟衰竭的人和小鼠心臟中miRNA-223的表達量也有明顯的上調，初步得出結論：miRNA-223參與調控心肌肥厚和心臟衰竭。接下來作者利用miR-223過表達轉基因小鼠以及miR-223基因敲除轉基因小鼠進一步驗證表型，結果發(fā)現(xiàn)miR-223過表達小鼠成年后出現(xiàn)明顯的心肌肥厚和心臟衰竭癥狀，而miR-223基因敲除小鼠表型相反，進一步證明在活體內，miR-223可以誘導心肌肥厚和心臟衰竭。
接下來作者進一步研究miR-223對心肌細胞的影響，結果發(fā)現(xiàn)miR-223過表達細胞中出現(xiàn)明顯的心肌肥大反應，而miR-223敲除細胞中，ISO處理引起的心肌肥大反應明顯被破壞，說明miR-223過表達會促進心肌肥厚，而miR-223基因敲除會阻斷心肌肥厚。
為了進一步研究miR-223調控心肌肥厚和心臟衰竭的分子機制，作者篩選了一些參與調控心肌肥厚的基因作為miR-223的靶標候選基因，然后通過western blot分析miR-223過表達和缺失突變體中上調以及下調的基因，結果發(fā)現(xiàn)miR-223可以顯著抑制ARC的表達，而前人已經有研究報道ARC參與調控心肌肥厚和細胞凋亡，所以初步推斷ARC可能是miR-223下游的靶標位點。
CircRNA和miRNA的互作是目前研究的一個熱點話題，為了進一步研究是否有CircRNA參與調控miR-223的表達，作者從CircRNA數(shù)據庫中隨機篩選出100個CircRNA，通過qRT-PCR驗證篩選到36個CircRNA，然后通過Northern blot篩選到一個特異性表達的CircRNA: mm9-circ-012559(HRCR)。
然后作者通過RNAhybrid分析發(fā)現(xiàn)HRCR包含6個CircRNA的靶標結合位點，初步表明HRCR可以和miR-223結合。接下來作者通過生物素標記，qRT-PCR，Northern bolt，pull down assay、熒光原位雜交（FISH）等技術手段，從正向以及反向兩個角度分別驗證HRCR和miR-223之間的互作關系，結果發(fā)現(xiàn)miR-223和HRCR在細胞質中存在共定位現(xiàn)象，HRCR可以直接結合到miR-223上。
HRCR和miR-223存在互作，而miR-223可以通過調控下游ARC的表達，進而調控心肌肥厚和心臟衰竭，為了進一步研究HRCR對ARC表達的影響，作者構建了HRCR過表達載體和基因敲除突變體，結果發(fā)現(xiàn)HRCR過表達載體中，ARC的表達量和活性顯著增加，HRCR敲除突變體中，ARC的表達量和活性顯著降低，并且HRCR可以消除miR-223對ARC表達的抑制作用，說明HRCR可以通過調控miR-223以及ARC的表達，進而調控心肌肥厚。
參考文獻
Wang K, Long B, Liu F, et al. A circular RNA protects the heart from pathological hypertrophy and heart failure by targeting miR-223.[J]. European Heart Journal, 2016, 37(33):2602-2611.
常見問題
1.全轉錄組測序為什么需要構建兩個文庫
全轉錄組測序需要構建2個測序文庫，一個小RNA文庫和一個去除核糖體RNA的鏈特異性文庫，然后分別上機測序。小RNA長度較短，一般小于50nt，采用測序策略為50SE。其他三類RNA序列一般大于200，通常在1000以上，最高可達幾萬，通過片段化構建150PE測序文庫。最后小RNA文庫可以獲得miRNA序列信息，去核糖體的鏈特異性文庫可以獲得mRNA、lncRNA和circRNA的序列信息。
2.什么是ceRNA調控網絡（ceRNA networks）。
這些非編碼RNA如lncRNA和circRNA等會競爭結合miRNA，導致miRNA調控的靶基因發(fā)生變化，最終體現(xiàn)在蛋白的表達水平上，而miRNA處于ceRNA調控網絡中的核心地位。如下圖
