長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200 nt 的非編碼RNA（ncRNA），廣泛存在于各種生物體內(nèi)，在表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用，與動植物的生長發(fā)育，人類的疾病發(fā)生有著密切關(guān)系，也可作為疾病診斷的標(biāo)志物或是重要靶點。
利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行l(wèi)ncRNA 測序及生物信息學(xué)分析，可快速準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)那些具有重要調(diào)控功能的lncRNA，分析其與特定生物學(xué)過程的關(guān)系，深入探索lncRNA的功能及其表達(dá)調(diào)控機制。包括競爭結(jié)合miRNA的ceRNA調(diào)控機制，及對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行一系列調(diào)控如增強子、啟動子、絕緣子等。
技術(shù)優(yōu)勢
1. 文庫優(yōu)化：采用核糖體去除和鏈特異性文庫構(gòu)建方案，保留了完整的lncRNA和mRNA序列，以及序列方向性。
2. 序列完整：對樣本中幾乎全部的lncRNA和mRNA序列進(jìn)行鑒定和分析。
3. 物種多元：對包括人類、動植物在內(nèi)的許多物種的lncRNA進(jìn)行鑒定和分析。
4. 分析嚴(yán)謹(jǐn)：系統(tǒng)收集lncRNA數(shù)據(jù)庫用于鑒定已知lncRNA，并設(shè)置嚴(yán)格的篩選條件用于發(fā)現(xiàn)新lncRNA。
5. 關(guān)聯(lián)全面：開展lncRNA與mRNA的關(guān)聯(lián)分析，深入分析lncRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
樣本起始量與送樣建議
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樣本類型 |
起始量 |
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動物及臨床臟器組織/腦組織等 |
>20mg |
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動物及臨床皮膚/骨/血管/脂肪組織等 |
>100mg |
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植物葉片組織/花 |
>200mg |
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植物根/莖/果實/種子 |
>500mg |
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原代細(xì)胞/細(xì)胞系 |
>5×106個 |
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中性粒細(xì)胞/嗜酸性粒細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞 |
>5×107個 |
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外泌體樣本 |
>1×108個 |
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血清/血漿/腦脊液/關(guān)節(jié)積液/卵泡液 |
>2mL |
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細(xì)胞培養(yǎng)上清液 |
>20mL |
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尿液 |
>30mL |
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總RNA |
>1μg且RIN>7.0 |
注意事項：
① 組織樣本建議保存在RNAlater、RNAHold、RNAProtect等相關(guān)組織保存液中，然后-80℃保存或干冰寄送；
② 細(xì)胞樣本使用TRIzol等裂解液充分裂解之后，-80℃保存或干冰寄送
③ 更加詳細(xì)的樣本準(zhǔn)備指南，請聯(lián)系在線客服
應(yīng)用場景
應(yīng)用場景1：啟動子/增強子調(diào)控
適用范圍：非線性轉(zhuǎn)錄調(diào)控、新順式作用元件發(fā)現(xiàn)及功能鑒定、組織特異性啟動子篩選及確定等研究
lncRNA的自身轉(zhuǎn)錄會干擾其鄰近編碼蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄。上游lncRNA轉(zhuǎn)錄時，會穿越鄰近靶基因的啟動子區(qū)，干擾了轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的啟動子結(jié)合，從而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。此外，lncRNA具有促進(jìn)增強子環(huán)化和激活基因表達(dá)的功能。在沒有成環(huán)的情況下增強子處于非活性狀態(tài)。
應(yīng)用場景2：與蛋白修飾/DNA甲基化/m6A聯(lián)合
適用范圍：臨床醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、植物遺傳育種等研究
lncRNA參與表觀調(diào)控，可能是招募一些染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體來介導(dǎo)基因沉默，尤其是一些與組蛋白修飾相關(guān)的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)控。此外，lncRNA還能與一些DNA甲基化和去甲基化酶結(jié)合使得基因的啟動子區(qū)發(fā)生甲基化的變化從而影響基因表達(dá)。
應(yīng)用場景3：ceRNA調(diào)控機制
適用范圍：環(huán)境應(yīng)激、臨床醫(yī)學(xué)、植物遺傳育種、疾病早期診斷等研究
ceRNA全稱competing endogenous RNA，是一種能夠競爭結(jié)合RNA的作用元件。通常lncRNA和circRNA會競爭結(jié)合miRNA，九游會j9一般把lncRNA和circRNA可以稱作ceRNA。ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)全稱ceRNAregulation network，指的是有ceRNA參與的整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)cascade。而ceRNA分析指的是對整個ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。一般有circRNA-miRNA-mRNA分析或lncRNA-miRNA-mRNA分析。
結(jié)果展示
不同樣本lncRNA基因組可視化結(jié)果為了更直觀的展示lncRNA candidate在染色體中分布情況，九游會j9采用circos(ww.circos.ca)軟件對篩選獲得的lncRNA進(jìn)行基因組mapping。
主要分為兩部分進(jìn)行展示，一部分按照lncRNA的不同分類進(jìn)行基因組mapping，另一部分按照不同樣本中l(wèi)ncRNA進(jìn)行基因組mapping。作圖時分別將每條染色體按照每25mb為基本單位，不同樣本中l(wèi)ncRNA基因組可視化作圖時統(tǒng)計每個區(qū)段中l(wèi)ncRNA的表達(dá)量繪圖，不同lncRNA類型基因組可視化時統(tǒng)計每個區(qū)段內(nèi)lncRNA的數(shù)目繪圖。
1.差異基因火山圖
通過繪制火山圖可以了解差異表達(dá)基因的整體分布情況。以log2 (foldchange)為橫坐標(biāo)，-log10(pvalue)為縱坐標(biāo)，對差異表達(dá)分析中所有的基因繪制火山圖。 其中橫坐標(biāo)代表基因在不同樣本中差異表達(dá)倍數(shù)變化；縱坐標(biāo)代表基因表達(dá)量變化差異的統(tǒng)計學(xué)顯著性；up顏色代表上調(diào)的顯著差異表達(dá)基因，down顏色代表下調(diào)的顯著差異表達(dá)基因，no代表非顯著性差異表達(dá)基因。
2.差異基因聚類熱圖
差異基因聚類分析用于判斷基因在不同實驗條件下調(diào)控模式的聚類模式。根據(jù)樣品基因表達(dá)譜的相近程度，將基因進(jìn)行聚類分析，直觀地展示基因在不同樣品（或是不同處理）中的表達(dá)情況，由此獲取生物學(xué)相關(guān)信息。為了更好的直觀反映聚類表達(dá)模式，對于非生物學(xué)重復(fù)
九游會j9采用log10(FPKM+1)進(jìn)行展示，對于生物學(xué)重復(fù)將差異基因FPKM通過Z值方式進(jìn)行基因表達(dá)展示。其中橫坐標(biāo)為樣本，縱坐標(biāo)為基因，不同的顏色表示不同的基因表達(dá)水平。
常見問題
1.什么是長鏈非編碼RNA？它們的作用有哪些？
哺乳動物基因組序列的約5%～10%被穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)編碼基因僅約占1%，其余4%～9%的序列都轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA。而非編碼RNA(non-coding RNA) 是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子。長鏈非編碼RNA為這4%～9%中長度大于200nt的非編碼RNA。它們的作用主要體現(xiàn)在四個方面：第一，影響周邊基因的表達(dá)；第二，調(diào)控蛋白質(zhì)活動及定位；第三，產(chǎn)生小分子RNA；第四，對其他RNA的調(diào)控作用。
2.lncRNA測序為什么需要構(gòu)建鏈特異性文庫？
很多基因組區(qū)域具有正負(fù)鏈的轉(zhuǎn)錄本，反義轉(zhuǎn)錄是真核基因的一個特征，是一種重要的調(diào)控方式。使用ssRNA-Seq（Strand-Specific）能夠保留RNA的方向性信息，可以確定轉(zhuǎn)錄本來自正鏈還是負(fù)鏈，以便更加準(zhǔn)確的獲得基因的結(jié)構(gòu)以及基因表達(dá)信息。
3.預(yù)測lncRNA與mRNA、miRNA互作的方法？
1）cis調(diào)控預(yù)測，篩選的條件只有cis location是100kb。（同一條染色體上距離lncRNA100kb的mRNA，都會被列入到cis調(diào)控的可能）
2）trans調(diào)控預(yù)測用的是RIsearch軟件，是以最小自由能小于-11來篩選堿基互補配對的lncRNA與mRNA。
3）在預(yù)測lncRNA與miRNA互作的時候， 用score罰分值來判定，一般≤4就認(rèn)定為可信，數(shù)值越小越可信。
