在轉(zhuǎn)錄后修飾中，N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是mRNA和lncRNAs上最為普遍的修飾之一。目前發(fā)現(xiàn)microRNA，circRNA, rRNA, tRNA和snoRNA上都有m6A修飾。m6A修飾主要發(fā)生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能主要由Writer、Eraser和Reader決定。Writer即甲基轉(zhuǎn)移酶，目前已知這個復合物的成分有METTL3，METTL14, METTL16, WTAP和KIAA1429等。而ALKBH5和FTO作為去甲基酶（Eraser）可逆轉(zhuǎn)甲基化。目前發(fā)現(xiàn)m6A結(jié)合蛋白（Reader）有YTH結(jié)構(gòu)域蛋白（YTHDF1, YTHDF2,YTHDF3,YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。
MeRIP-seq則是研究m6A修飾強有力的技術(shù)之一。MeRIP-seq是將MeDIP、RIP及RNA-seq技術(shù)結(jié)合起來，在全基因組范圍內(nèi)檢測RNA甲基化。利用特異性的RNA甲基化抗體進行免疫共沉淀反應，將獲得的甲基化修飾片段進行測序，同時，設(shè)計Input對照樣本消除背景。
技術(shù)優(yōu)勢
攜手RNA甲基化研究國際知名團隊，深度優(yōu)化實驗與分析流程；
提煉數(shù)十篇頂級RNA甲基化文章思路，量身定制前沿實驗方案；
提供多組學整合分析與功能驗證一站式服務，大幅縮短實驗周期；
一流的數(shù)據(jù)挖掘團隊+豐富的論文審稿經(jīng)驗，加速科研成果發(fā)表。
樣本起始量與送樣建議
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樣本類型 |
起始量 |
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細胞 |
>5x106 |
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動物組織 |
>100 mg |
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植物 |
>5 g |
注意事項：詳細樣本準備指南，請聯(lián)系在線客服。
分析內(nèi)容
1. 測序序列統(tǒng)計與質(zhì)控
2. 參考基因組比對：參考基因組比對Reads統(tǒng)計、參考基因組比對區(qū)域分布、測序數(shù)據(jù)比對分布
3. 全基因組Peak掃描：Peak calling、Peak注釋
4. 差異Peak分析：差異Peak信息統(tǒng)計、差異Peak基因GO富集分析、差異Peak基因KEGG富集性分析
5. Motif分析
案例展示
客戶案例1：m6A調(diào)控miRNA初級體識別加工
論文標題：N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing
刊登日期：2015年03月
發(fā)表雜志：Nature
影響因子：40.1
研究機構(gòu)：美國洛克菲勒大學
在miRNA生物合成的第一步是在微處理蛋白復合物的幫助下對初級microRNA（pri-miRNA）進行加工。微處理蛋白復合物由RNA結(jié)合蛋白DGCR8和III型核糖核酸酶Drosha組成。這個起始事件需要DGCR8識別pri-miRNA發(fā)夾上莖和側(cè)翼單鏈RNA的連接處，并招募Drosha剪切雙鏈RNA產(chǎn)生前體miRNA（pre-miRNA）。pri-miRNA的加工機制已經(jīng)被闡釋，但是目前并不知道DGCR8在眾多具有二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本中識別和結(jié)合pri-miRNA的機制。
本研究中，洛克菲勒大學Dr.Tavazoie教授發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細胞中，METTL3會使pri-miRNA發(fā)生甲基化，標記的pri-miRNA可以被DGCR8的識別和加工。通過miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)，敲低METTL3會降低DGCR8與pri-miRNA的結(jié)合作用，引起成熟體miRNA表達量降低，通過未經(jīng)加工pri-miRNA含量增加。體外實驗證實m6A會促進pri-miRNA的加工。最后，功能驗證實驗揭示METTL3能夠促使miRNA成熟。所以m6A標記是一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后修飾，會促進miRNA生物合成的起始。
客戶案例2：m6A識別酶HNRNPA2B1介導RNA加工
論文標題：HNRNPA2B1 Is a Mediator of m6A-Dependent Nuclear RNA Processing Events
刊登日期：2015年09月
發(fā)表雜志：Cell
影響因子：30.4
研究機構(gòu)：美國洛克菲勒大學
已知m6A是mRNA中最普遍的一種內(nèi)部修飾方式之一。各種轉(zhuǎn)錄本如mRNA、lncRNA等上攜帶的m6A修飾能夠影響RNA在細胞核中的“命運”如RNA降解以及轉(zhuǎn)錄后加工等。洛克菲勒大學Dr.Tavazoie教授在文中驗證了一種RNA結(jié)合蛋白HNRNPA2B1能夠特異性識別轉(zhuǎn)錄本上的m6A修飾。這些發(fā)生m6A修飾的位點所在的motif與甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3 motif相匹配。此外HNRNPA2B1能夠直接與發(fā)生m6A修飾的miRNA初級體（pri-miRNA）相結(jié)合，與miRNA微處理蛋白復合物之一DGCR8一起促使pri-miRNA成熟體的加工。
參考文獻
1. Alarcón C R, Lee H, Goodarzi H, et al. N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing[J]. Nature, 2015, 519(7544):482.
2. Alarcón C R, Goodarzi H, Lee H, et al. HNRNPA2B1 Is a Mediator of m(6)A-Dependent Nuclear RNA Processing Events.[J]. Cell, 2015, 162(6):1299-1308.
常見問題
1.樣本處理有什么特殊的要求嗎？
樣本處理方法根據(jù)實驗室是否有液氮分為如下兩種情況：
有液氮的情況：
組織樣品離體后，快速用RNase-free配制的生理鹽水/PBS清洗樣本表面的污漬，并吸干表面的液體，迅速的將樣本分割成長寬高<=0.5cm的小塊（一般重約100mg，不過無需精準測量，一般需要10個小塊左右），將樣本放入已標記好名稱且預冷好的Rnase-free的螺紋管中（不要將蓋子擰死，以免從液氮中取出時破裂），迅速投入液氮中速凍>=1h，然后取出置于-80℃保存，干冰運輸。
沒有液氮的情況：
提前準備好RNase-free的1.5mL的EP管，向其中加入1mL的RNAfixer。
組織樣品離體后，快速用RNase-free生理鹽水/PBS清洗樣本表面的污漬，并吸干表面的液體，迅速的將樣本分割成長寬高<=0.5cm，約豌豆大小的小塊（一般重約100mg，不過無需精準測量，一般需要10個小塊左右），然后投入提前準備好的1.5mL的EP管中，使樣本完全浸沒在液體中，然后置于-80℃中保存，干冰運輸。
注意：實驗操作過程中請務必確保無RNA酶污染。
2.m6A檢測方法有哪些，只能用測序的方法來檢測嗎？
定量方法：LC-MS/MS、EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit（比色法）
高通量測序：m6A-seq（MeRIP-seq）、miCLIP-seq
定量方法只能檢測整體m6A水平，無單堿基分辨率；但是測序方法則沒有此限制。您可以根據(jù)實驗的具體需求選擇對應的檢測方法。
