背景
中藥既是歷史上重要的治療藥物，也是新藥的重要來源。常山酮（HF）是一種由熱敷皂苷衍生而來的小分子生物堿，在不同的細(xì)胞系中具有明顯不同的抗增殖作用。然而，HF在體外是能抑制MCF-7細(xì)胞的生長以及這一過程的潛在機(jī)制尚不清楚。
外泌體是一種由細(xì)胞自然分泌的納米大小的囊泡，大小在30-150nm。它由各種脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNA組成，包括microRNAs（miRNAs），這些分子通過外泌體可以在細(xì)胞間傳遞，起到了直接或間接的通訊作用。
本文[1]作者發(fā)現(xiàn)HF不僅能抑制MCF-7細(xì)胞外泌體的分泌，同時(shí)降低了外泌體中microRNA-31（miR-31）的含量。MiR-31通過靶向HDAC2，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的水平，有助于HF的抗癌功能。
Results
1.HF對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長的影響
為了探究HF是否對MCF-7細(xì)胞的生長產(chǎn)生影響，作者設(shè)置不同的HF濃度（25、50、100、200和400nM）和不同的時(shí)間點(diǎn)（0、12、24和48hr），并通過MTT和克隆形成檢測細(xì)胞的生長情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，HF對體外培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞的生長具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性的抑制作用（Figure.1）。
Figure 1 HF能抑制人類乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖
2.HF處理可減少M(fèi)CF-7細(xì)胞的外泌體分泌
為了驗(yàn)證中藥是否抑制MCF-7細(xì)胞的外泌體分泌，作者用HF處理MCF-7細(xì)胞并檢測了腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的外泌體量。作者隨后分別檢測了AChE酶活（一種與外泌體膜相關(guān)的特殊酶）、BCA濃度、透射電鏡（TEM）及外泌體蛋白（Tsg101、CD63、CD81和CD9），通過這些數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)HF可抑制MCF-7細(xì)胞外泌體的分泌（Figure.2）。
Figure 2 HF處理可減少M(fèi)CF-7外泌體的分泌
3.HF通過抑制外泌體的分泌來抑制MCF-7細(xì)胞的增殖
作者先用DiD染料標(biāo)記MCF-7細(xì)胞分泌的外泌體，再將此外泌體與MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察到外泌體分布在MCF-7細(xì)胞質(zhì)中。隨后作者用不同劑量的外泌體來處理MCF-7細(xì)胞，并用MTT法檢測MCF-7細(xì)胞的增殖情況。作者發(fā)現(xiàn)，隨著劑量的增加，MCF-7細(xì)胞的增殖也隨著提升。接著作者考察了HF和GW4869（一種中性神經(jīng)鞘磷脂酶抑制劑）對外泌體分泌的影響。數(shù)據(jù)表明，經(jīng)GW4869預(yù)處理后，HF對MCF-7細(xì)胞分泌外泌體的抑制作用將更明顯。此外，用HF和non-HF外泌體處理MCF-7細(xì)胞，結(jié)果顯示，HF對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用減弱?？傊?，這些數(shù)據(jù)揭示了HF抑制外泌體分泌可能是HF抑制MCF-7細(xì)胞生長的機(jī)制（Figure.3）。
Figure 3 MCF-7來源的外泌體對細(xì)胞增殖的影響
?4.HF通過降低外泌體miR-31抑制MCF-7增殖
作者檢測了外泌體中84個(gè)與乳腺癌相關(guān)的miRNAs，發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞在有HF處理和沒有HF處理下外泌體中的miRNAs有很大不同，其中miR-31在HF處理過的外泌體中比non-HF處理的外泌體中更少。隨后作者敲低了外泌體中的miR-31，將此外泌體加入受體細(xì)胞培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)敲低miR-31后外泌體對細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)。接著作者過表達(dá)了外泌體中的miR-31，發(fā)現(xiàn)外泌體促進(jìn)細(xì)胞的增殖。因此，這些數(shù)據(jù)表明外泌體miR-31能夠促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖（Figure.4）。
?Figure 4 外泌體miR-31能促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖
5.miR-31通過靶向HDAC2調(diào)節(jié)MCF-7細(xì)胞的生長
作者分別用miR-31 inhibitor、mimics或HF刺激MCF-7細(xì)胞，來改變MCF-7細(xì)胞分泌的外泌體中miR-31的水平，再用shotgun LC-MS/MS蛋白組學(xué)技術(shù)檢測受體細(xì)胞MCF-7中核蛋白的差異表達(dá)情況。結(jié)果顯示，表達(dá)了miR-31 pre-miRNA的外泌體可抑制HDAC2的表達(dá)。此外，miR-31敲低/過表達(dá)或HF處理過的外泌體可調(diào)節(jié)HDAC2的表達(dá)和H3、H4乙?；纳险{(diào)或下調(diào)。抑制HDAC2的表達(dá)可明顯抑制MCF-7細(xì)胞的增長速率?？傊?，這些結(jié)果表明miR-31通過靶向HDAC2調(diào)節(jié)MCF-7細(xì)胞的生長（Figure.5）。
?Figure 5 miR-31通過靶向HDAC2抑制MCF-7細(xì)胞的增殖
6.HDAC2通過靶向MCF-7細(xì)胞中的G1/S組分對細(xì)胞周期環(huán)路起調(diào)控作用
作者接著檢測了HDAC2對細(xì)胞周期的調(diào)控作用。HDAC2敲低后會(huì)使G1期細(xì)胞增加，S期和G2/M期減少，這說明了HDAC2參與了細(xì)胞周期時(shí)鐘的調(diào)控。在MCF-7細(xì)胞G1/S過渡過程中，HDAC2敲低可以抑制細(xì)胞周期的組分水平，包括cyclin D1和CDK2，同時(shí)增加細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子p21的水平。此外，HDAC2敲低通過CDK2和cyclin D1轉(zhuǎn)錄激活影響pRb（retinoblastoma protein）蛋白磷酸化。
隨后作者也檢測了用HF或miR-31 pre-miRNA處理細(xì)胞后其分泌的外泌體對cyclin D1、CDK2和p21的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與non-HF外泌體處理組相比，HF外泌體能抑制cyclin D1、CDK2水平，同時(shí)提高p21水平；與對照組相比，來自miR-31 pre-miRNA處理MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體降低p21水平、增加CDK2和cyclin D1水平（Figure.6）。
Figure 6 HDAC2通過靶向G1/S轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)組分抑制乳腺癌細(xì)胞的生長
總之，這些結(jié)果揭示了HF處理會(huì)減少M(fèi)CF-7細(xì)胞外泌體的釋放（包含miR-31），該外泌體可轉(zhuǎn)移miR-31到鄰近細(xì)胞，有助于抑制HDAC2表達(dá)。同時(shí)HDAC2可通過調(diào)節(jié)G1/S組分，如p21、CDK2和cyclin D1來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，從而抑制MCF-7細(xì)胞增殖(Figure.7）。
Figure 7 微環(huán)境中HF抑制MCF-7細(xì)胞增殖的機(jī)制
文章總結(jié)
本文作者驗(yàn)證了HF通過減少腫瘤來源外泌體的產(chǎn)生，在體外抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，同時(shí)也觀察到MCF-7受體細(xì)胞可以有效地吸收MCF-7供體細(xì)胞分泌的含miR-31的外泌體。此外，作者發(fā)現(xiàn)，增加外泌體miR-31含量可下調(diào)HDAC2基因的表達(dá)，而HDAC2基因通過調(diào)控MCF-7受體細(xì)胞中的G1/S組分如p21、CDK2和cyclinD1來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期環(huán)路，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。
參考文獻(xiàn)
[1] miR-31 shuttled by halofuginone-induced exosomes suppresses MFC-7 cell proliferation by modulating the HDAC2/cell cycle signaling axis. J Cell Physiol. 2019 Aug;234(10):18970-18984.doi: 10.1002/jcp.28537. Epub 2019 Mar 27.
