摘要
溫州醫(yī)科大學(xué)叢維濤教授研究團(tuán)隊(duì)在Redox Biology發(fā)表文章“The protective effects of fibroblast growth factor 10 against hepatic ischemia-reperfusion injury in mice”首次對FGF10在肝臟缺血再灌注損傷IRI中的功能及信號通路進(jìn)行研究，研究發(fā)現(xiàn)，肝臟IRI小鼠，F(xiàn)GF10在再灌注期高表達(dá)；體外研究顯示，F(xiàn)GF10主要由肝星狀細(xì)胞（HSCs）分泌作用肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。在肝臟IRI損傷早期，F(xiàn)GF10過表達(dá)可以減輕肝功能障礙，減少壞死和炎癥，防止肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡。在肝臟IRI損傷后期，F(xiàn)GF10過表達(dá)可以促進(jìn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF10過表達(dá)通過激活PI3K/AKT信號通路，激活NRF2、減少氧化應(yīng)激反應(yīng)。
背景介紹
肝臟缺血再灌注損傷（IRI）是肝損傷過程中嚴(yán)重的并發(fā)癥，可分為急性損傷早期和后期恢復(fù)期【1，2】。有文獻(xiàn)報道，急性損傷早期，活性氧（ROS）過量產(chǎn)生可以破壞氧化還原平衡，誘導(dǎo)氧化還原信號通路，例如JNK1/2和NF-kB通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)；恢復(fù)期，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞生長和增殖能力提升，肝臟再生功能增強(qiáng)【2-4】。
纖維母細(xì)胞生長因子（FGF）在器官發(fā)育、修復(fù)、代謝和平衡中發(fā)揮重要作用【5】。間質(zhì)上皮信號生長因子（FGF10）在肝臟、腎臟、脂肪發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)GF10可以結(jié)合FGFR2b，通過FGFR2b參與調(diào)解下游通路；FGF10也可以結(jié)合FGFR1b，但是結(jié)合效率較低【6,7】。有研究顯現(xiàn)，胚胎肝臟發(fā)育期，F(xiàn)GF10/FGFR2b信號通路激活β-catenin調(diào)節(jié)肝臟大小和肝母細(xì)胞存活率【8】；成年時期，F(xiàn)GF10過表達(dá)增加肝細(xì)胞，促進(jìn)肝臟切除后再生【9】。然而，F(xiàn)GF10在肝臟IRI中的作用機(jī)制尚不清晰，因此，叢維濤教授研究團(tuán)隊(duì)對FGF10在肝臟IRI中的作用及機(jī)制進(jìn)行了探究。
結(jié)果
肝臟IRI時期FGF10顯著上調(diào)
首先對FGF10與肝臟IRI相關(guān)性進(jìn)行研究，研究發(fā)現(xiàn)，肝臟IRI術(shù)后，肝臟FGF10表達(dá)顯著增高；術(shù)后6h， 肝臟FGF10表達(dá)達(dá)到高峰；并且肝臟壞死區(qū)域FGF10表達(dá)增加明顯（圖1A-C），說明FGF10在IRI早期表達(dá)，且在肝臟功能中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，F(xiàn)GF10/FGFR2b介導(dǎo)的間充質(zhì)-上皮信號通路在多種組織中發(fā)揮重要作用；在肝臟中，有研究表明，肌成纖維細(xì)胞/星狀細(xì)胞（HSCs）表達(dá)FGF10，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表達(dá)FGFR2b。因此，研究人員分離的原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和HSCs進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)缺氧（H/R）刺激后FGF10在原代HSCs中表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)GFR2b在原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，同時研究人員對FGF10和FGFR2b在肝細(xì)胞系中的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其與原代細(xì)胞結(jié)果一致（圖1D-G）。
圖1 肝臟IRI期間FGF10表達(dá)顯著上調(diào)
ROS介導(dǎo)HSCs細(xì)胞FGF10表達(dá)，F(xiàn)GF10通過FGFR2b作用于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞
接下來，研究者對HSCs如何感知IRI損傷并釋放FGF10進(jìn)行研究。FGF10在IRI早期顯著增加，同時ROS在此時期也起到關(guān)鍵作用，因此研究者猜想：ROS在肝臟IRI損傷后HSCs激活 FGF10表達(dá)過程中起重要作用。為證實(shí)這一猜想，研究者首先利用H2O2刺激小鼠原代HSCs，結(jié)果顯示H2O2處理后，α-SMA和FGF10表達(dá)均顯著上升，NAC抗氧化結(jié)果顯示，NAC可以顯著抑制H/R模型α-SMA和FGF10表達(dá)（圖2A-B）。以上結(jié)果證明，肝臟IRI中ROS導(dǎo)致HSCs激活FGF10表達(dá)。
為了確定FGFR2b和FGFR1b的作用，在外源rFGF10處理肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)pFRS2α和pAKT表達(dá)顯著增高，rFGF10 處理FGFR2b敲低的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞pFRS2α和pAKT表達(dá)被抑制，然而FGFR1b敲低后，rFGF10依然可以促進(jìn)pFRS2α和pAKT表達(dá)（圖2C-D）。因此，F(xiàn)GF10極有可能通過FGFR2b作用肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
圖2 ROS介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞FGF10表達(dá)，F(xiàn)GF10 通過FGFR2b作用肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞
FGF10改善肝臟IRI過程中肝損傷調(diào)節(jié)AKT激活
為了確定FGF10在肝臟IRI中的作用，研究人員利用AAV病毒載體對肝臟中的FGF10進(jìn)行基因操作。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟IRI后6h肝臟壞死嚴(yán)重，肝臟中過表達(dá)FGF10在肝臟IRI中起到保護(hù)作用，減少肝臟的壞死面積，敲低FGF10表達(dá)加重肝臟IRI后的肝臟壞死面積（圖3A&圖4A）。
有研究顯示，AKT信號通路在肝臟IRI過程中促進(jìn)肝細(xì)胞生存和改善肝臟損傷【10】，另外PI3K/AKT信號通路是FGF10信號下游重要的靶點(diǎn)【6】。因此，研究者對FGF10和AKT激活的關(guān)系進(jìn)行研究，研究發(fā)現(xiàn)FGF10過表達(dá)磷酸化AKT和GSK3β均增加，然而，敲低FGF10結(jié)果與之相反（圖3B&圖4B）。因此FGF10在肝臟IRI過程中AKT激活起重要作用。
此外，MAPK信號通路在調(diào)節(jié)肝臟IRI中發(fā)揮重要作用【11】，對MAPK家族在肝臟IRI的作用進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，MAPK成員在肝臟IRI后的激活均有顯著變化；然而，F(xiàn)GF10對MEK/ERK激活沒有顯著影響，JNK1/2與p38的磷酸化對FGF10有明顯的依賴性（圖3C-D&圖4C-D）。
圖3 FGF10過表達(dá)促進(jìn)肝臟IRI過程中AKT激活改善肝臟損傷
圖4 干擾FGF10表達(dá)抑制肝臟IRI過程中AKT激活加重肝臟損傷
FGF10保護(hù)損傷期肝細(xì)胞凋亡促進(jìn)修復(fù)期肝細(xì)胞增殖
細(xì)胞凋亡是造成肝臟IRI損傷的重要原因，因此研究者對FGF10在肝臟IRI細(xì)胞凋亡與增殖進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟IRI術(shù)后6h肝臟細(xì)胞凋亡顯著增多，并且c-CAS-3與促凋亡基因Bax/抑制凋亡基因Bcl-2顯著增加；肝臟IRI恢復(fù)期，肝細(xì)胞增殖增加；FGF10過表達(dá)抑制肝細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝細(xì)胞增殖（圖5）；干擾FGF10表達(dá)則與之相反(圖6)。因此，F(xiàn)GF10在肝臟IRI后細(xì)胞增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用。
圖5 FGF10過表達(dá)保護(hù)肝臟IRI損傷期肝細(xì)胞凋亡促進(jìn)修復(fù)期細(xì)胞增殖
圖6 干擾FGF10表達(dá)加重肝臟IRI損傷期細(xì)胞凋亡抑制修復(fù)期細(xì)胞增殖
FGF10 抑制肝臟IRI免疫反應(yīng)
肝臟IRI過程中組織損傷和肝功能與恢復(fù)會引發(fā)炎癥反應(yīng)，因此研究人員對肝臟IRI過程中的炎癥反應(yīng)進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟IRI損傷6h后，巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68和中性粒細(xì)胞標(biāo)志物MPO均顯著增加，NF-KB信號通路IkBα和p65磷酸化增加，多種炎癥因子和化學(xué)因子也顯著增加；FGF10過表達(dá)抑制肝臟損傷后CD68和MPO水平、抑制IkBα和p65磷酸化以及抑制炎癥因子和化學(xué)因子水平（圖7）；干擾FGF10表達(dá)結(jié)果則相反（圖8）。以上結(jié)果說明，F(xiàn)GF10在肝臟IRI起抗炎作用。
圖7 FGF10過表達(dá)抑制肝臟IRI免疫應(yīng)激反應(yīng)
圖8 干擾FGF10表達(dá)加重肝臟IRI免疫應(yīng)激反應(yīng)
FGF10抑制肝臟IRI氧化應(yīng)激反應(yīng)、通過AKT信號通路激活NRF2
因?yàn)榍捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)肝臟IRI損傷前期FGF10表達(dá)增高并且ROS誘導(dǎo)HSCs FGF10表達(dá)增加，所以研究人員對肝臟IRI后FGF10表達(dá)對氧化應(yīng)激的作用進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟IRI后6h過表達(dá)FGF10抑制ROS產(chǎn)生，LPO、GSSG/GSH水平降低（圖9A-B），說明FGF10抑制肝臟IRI過程中ROS產(chǎn)生。NRF2作為一種強(qiáng)抗氧化劑，F(xiàn)GF10過表達(dá)肝臟IRI后核內(nèi)NRF2和總NRF2表達(dá)均有顯著增加，且NRF2下游NQO-1也顯著增加（圖9C）。NRF2作為AKT的下游靶點(diǎn)，因此利用PI3K抑制劑（LY294002）抑制PI3K/AKT信號通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LY294002抑制FGF10對肝臟IRI的抗氧化作用（圖9D-F）。所以，過表達(dá)FGF10通過PI3K/AKT信號通路激活NRF2對肝臟IRI起保護(hù)作用。
圖9 FGF10抑制肝臟IRI氧化應(yīng)激、通過AKT信號通路激活NRF2
FGF10介導(dǎo)的肝臟IRI肝細(xì)胞保護(hù)依賴NRF2
為確定FGF10介導(dǎo)的肝臟IRI保護(hù)作用是否NRF2依賴，所以利用AAV載體過表達(dá)FGF10對NRF2敲除小鼠肝臟IRI進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)FGF10對NRF2敲除小鼠的ALT/AST、細(xì)胞凋亡、免疫細(xì)胞、ROS和多種因子水平均沒有明顯的變化（圖10）。
圖10 FGF10介導(dǎo)的肝臟IRI肝細(xì)胞保護(hù)作用依賴NRF2
小結(jié)
FGF10在肝臟IRI中起保護(hù)作用。FGF10誘導(dǎo)及AKT 依賴的NRF2激活促進(jìn)肝臟IRI損傷后的肝臟修復(fù)及維持肝臟內(nèi)平衡。以上這些研究結(jié)果可以加深對FGF10在肝臟調(diào)節(jié)作用機(jī)制，并且為今后肝臟IRI治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。
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