共濟(jì)失調(diào)（Ataxia）是一類以運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性紊亂為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，臨床表現(xiàn)包括步態(tài)不穩(wěn)、喪失平衡、吞咽困難、眼球運(yùn)動(dòng)異常、肌張力受損等。其中，遺傳性共濟(jì)失調(diào)具有高度的臨床和遺傳異質(zhì)性，病死率和病殘率較高，約占神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病的10%～15%，目前此類疾病的治療仍為世界難題。2014-2015年，兩個(gè)國際研究團(tuán)隊(duì)分別報(bào)道了一種新型遺傳性共濟(jì)失調(diào)（spinocerebellar ataxia, autosomal recessive 20, SCAR20）[1, 2]，SCAR20患者表現(xiàn)為早發(fā)性小腦萎縮和嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)失衡，全基因組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病是由SNX14基因突變所致，但具體發(fā)病的機(jī)制未知，治療更無從談起。
2020年，廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所王鑫教授團(tuán)隊(duì)在《國家科學(xué)評論》（National Science Review）上發(fā)表題為“SNX14 deficiency-induced defective axonal mitochondrial transport in Purkinje cells underlies cerebellar ataxia and can be reversed by valproate”的研究成果[3]。該研究首次從軸突線粒體運(yùn)輸這一全新視角揭示了一類遺傳性共濟(jì)失調(diào)（spinocerebellar ataxia, autosomal recessive 20, SCAR20）的發(fā)病機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)抗癲癇藥--丙戊酸大幅度減緩模型小鼠的疾病進(jìn)程，具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化應(yīng)用價(jià)值，有望為共濟(jì)失調(diào)提供新的治療手段。
作者簡介：
王鑫，廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所教授、博士生導(dǎo)師，國家自然科學(xué)基金優(yōu)青項(xiàng)目獲得者（2018年），福建省“閩江學(xué)者”特聘教授，福建省“百人計(jì)劃”專家，廈門市首屆杰出青年人才。王鑫教授課題組主要致力于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的致病機(jī)理和藥物靶點(diǎn)探索。近年在Nat Med、Natl Sci Rev、Sci Adv、PloS Biol等國際知名學(xué)術(shù)期刊發(fā)表研究論文20余篇。王鑫教授課題組因工作需要，熱忱歡迎優(yōu)秀博士后加盟，同時(shí)歡迎優(yōu)秀學(xué)子報(bào)考廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所王鑫教授課題組研究生。聯(lián)系方式：wangx@xmu.edu.cn
結(jié)果
1.SCAR20的“罪魁禍?zhǔn)?rdquo;是小腦浦肯野細(xì)胞的自發(fā)性死亡
首先，研究人員通過Snx14flox/flox（Snx14f/f）小鼠和Nestin-Cre小鼠（由Nestin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的Cre重組酶，Nestin在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞前體表達(dá)）雜交構(gòu)建Snx14條件性敲除小鼠（cKO）模擬SCAR20疾病模型，并借助旋轉(zhuǎn)桿和平衡木行為學(xué)范式發(fā)現(xiàn)，特異性敲除中樞神經(jīng)系統(tǒng)Snx14可導(dǎo)致小鼠從1月齡開始出現(xiàn)SCAR20表型，表現(xiàn)為輕度運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性紊亂，且在2、3月齡時(shí)，其運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性紊亂現(xiàn)象逐漸惡化（圖1A-C）。
接下來，作者借助組織學(xué)和病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，cKO小鼠的浦肯野細(xì)胞明顯減少（圖1D,E）。同時(shí)，平衡木行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，浦肯野細(xì)胞數(shù)量與足部滑移呈負(fù)相關(guān)（圖1F），這提示了小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性紊亂中存在Snx14依賴的浦肯野細(xì)胞變性。進(jìn)一步，作者借助浦肯野細(xì)胞標(biāo)記物碳酸堿酶8（carbonic anhydrase 8, CA8）進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Snx14f/f小鼠中約為16%的CA8陽性的浦肯野細(xì)胞軸索腫脹，透射電鏡（TEM）觀察發(fā)現(xiàn)，在這些腫脹的軸突中線粒體、溶酶體和其他細(xì)胞器出現(xiàn)異常積累（圖1G-I）。
圖1 SNX14缺陷導(dǎo)致小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性紊亂和浦肯野細(xì)胞變性
由于Snx14 mRNA主要在小鼠小腦的浦肯野細(xì)胞中表達(dá)[Allen Brain Atlas]，基于此，研究人員通過將Snx14f/f與Pcp2-Cre轉(zhuǎn)基因鼠雜交，構(gòu)建浦肯野細(xì)胞特異性Snx14 KO（Snx14f/f:Pcp2-Cre）小鼠模型。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3、4月齡的Snx14f/f:Pcp2-Cre小鼠表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性障礙現(xiàn)象（圖2A）。此外，與cKO小鼠類似，隨著年齡的增長，Snx14f/f:Pcp2-Cre小鼠浦肯野細(xì)胞受損，出現(xiàn)軸突腫脹現(xiàn)象（圖2B-F）。
Allen Brain Atlas (www.brainatlas.org)
圖2 Snx14缺失導(dǎo)致浦肯野細(xì)胞的細(xì)胞自發(fā)性死亡
上述結(jié)果提示了，SCAR20的“罪魁禍?zhǔn)?rdquo;是小腦浦肯野細(xì)胞的自發(fā)性死亡，浦肯野細(xì)胞死亡產(chǎn)生的細(xì)胞碎片激活小膠質(zhì)細(xì)胞，繼而進(jìn)一步促進(jìn)浦肯野細(xì)胞死亡，形成惡性循環(huán)。至終末期，浦肯野細(xì)胞幾乎消亡殆盡。
2.Snx14缺陷導(dǎo)致浦肯野細(xì)胞線粒體功能障礙
接下來，為探究SCAR20中浦肯野細(xì)胞自發(fā)性死亡的分子機(jī)制，作者借助TMT定量蛋白組學(xué)技術(shù)對1月齡的Nestin-Cre和cKO鼠小腦的整體蛋白質(zhì)組表達(dá)譜進(jìn)行了分析，共鑒定出222個(gè)差異表達(dá)蛋白（differentially expressed proteins, DEPs）顯著上調(diào)，352個(gè)DEPs顯著下調(diào)（圖3A）。值得注意的是，這些下調(diào)的DEPs中觀察到線粒體富集現(xiàn)象（圖3B）。
浦肯野細(xì)胞是脊椎動(dòng)物腦內(nèi)體積最大的神經(jīng)元之一，其樹突分支極其精細(xì)、復(fù)雜，每個(gè)神經(jīng)元可接受來自上游2萬個(gè)顆粒細(xì)胞的軸突投射，如此龐大的細(xì)胞“機(jī)器”運(yùn)作需要巨大的能量供應(yīng)，同時(shí)對能量缺乏異常敏感。通過對小腦進(jìn)行系統(tǒng)的組學(xué)分析和功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，cKO鼠小腦中浦肯野細(xì)胞的線粒體功能缺陷、活性氧自由基過度產(chǎn)生（圖3C-H）。作為細(xì)胞的“能量工廠”，線粒體功能受損對能量需求旺盛的浦肯野細(xì)胞無疑是致命打擊。
圖3 Snx14缺陷導(dǎo)致浦肯野細(xì)胞線粒體功能障礙
3.Snx14缺陷導(dǎo)致Spastin蛋白降解，影響線粒體運(yùn)輸
進(jìn)一步，作者借助TEM觀察到在Snx14 缺失的浦肯野細(xì)胞腫脹的軸突中，出現(xiàn)線粒體聚集和微管紊亂現(xiàn)象（圖4A-C）。由于軸突“貨物”運(yùn)輸依賴于線性微管組織，因此，研究人員利用實(shí)時(shí)顯微成像技術(shù)監(jiān)測Snx14缺陷神經(jīng)元軸突中的線粒體運(yùn)動(dòng)。結(jié)果顯示，Snx14缺失神經(jīng)元軸突中運(yùn)動(dòng)的線粒體數(shù)量明顯減少，導(dǎo)致線粒體順逆行運(yùn)輸受損（圖4D）。隨后，研究人員借助蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)SNX14通過與微管剪切蛋白Spastin相互作用發(fā)揮功能，SNX14缺陷導(dǎo)致Spastin蛋白降解（圖4E-J），從而影響神經(jīng)元軸突中微管的正常剪切，破壞微管結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)性，進(jìn)而使依賴微管運(yùn)輸?shù)?ldquo;貨物”（線粒體等細(xì)胞器）“派送”異常，導(dǎo)致浦肯野細(xì)胞因細(xì)胞能量供應(yīng)障礙而死亡。
圖4 SNX14缺失破壞微管結(jié)構(gòu)和線粒體運(yùn)輸
4.丙戊酸改善小鼠的SCAR20表型
基于上述結(jié)果，該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步從改善軸突運(yùn)輸和線粒體功能入手尋找治療的藥物。丙戊酸（valproate,VPA）作為抗癲癇常用藥而被人們熟知，其臨床應(yīng)用已接近60年，藥效及安全性較為明確。值得一提的是，VPA在神經(jīng)元軸突重塑和生長方面具有重要調(diào)控作用[4-5]，利用這一功能，研究人員嘗試對SCAR20模型小鼠進(jìn)行治療。他們在出生后25天（P25）cKO小鼠連續(xù)35天腹腔注射VPA，隨后檢測其行為和小腦生理變化（圖5A）。結(jié)果顯示，慢性注射VPA可顯著改善cKO小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性（圖5B），同時(shí)，VPA還改善了在小腦分子層（molecular layer,ML）的厚度，抑制了浦肯野細(xì)胞的丟失，并恢復(fù)了相關(guān)基因信號(hào)（圖5C-F）。此外，體外培養(yǎng)浦肯野細(xì)胞，經(jīng)VPA處理后，Snx14 KO浦肯野細(xì)胞的細(xì)胞大小和分支復(fù)雜度也得到改善（圖5H,I）。
圖5 VPA改善Snx14 缺陷小鼠共濟(jì)失調(diào)表型
最后，研究人員對VPA的治療機(jī)制進(jìn)行探討。發(fā)現(xiàn)VPA可以顯著改善軸突病變及微管紊亂現(xiàn)象（圖6A-C），此外，VPA處理也緩解了Snx14缺失的浦肯野細(xì)胞中線粒體軸突異常積累（6D），同時(shí)，借助延時(shí)顯微鏡對軸突線粒體運(yùn)動(dòng)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)VPA可以顯著恢復(fù)Snx14 KO神經(jīng)元線粒體運(yùn)輸和功能（圖6E-G）。
圖6 VPA恢復(fù)了線粒體功能和運(yùn)輸
結(jié)論
該研究通過構(gòu)建多個(gè)Snx14條件性敲除小鼠模型，證實(shí)引起SCAR20的“罪魁禍?zhǔn)?rdquo;是小腦浦肯野細(xì)胞的自發(fā)性死亡。接下來，作者借助系統(tǒng)的組學(xué)分析、功能學(xué)研究、行為學(xué)等技術(shù)手段揭示SCAR20中浦肯野細(xì)胞自發(fā)性死亡的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Snx14缺失可導(dǎo)致浦肯野細(xì)胞的線粒體功能缺陷、活性氧自由基過度產(chǎn)生，此外，SNX14通過與微管剪切蛋白Spastin相互作用發(fā)揮功能，SNX14缺陷導(dǎo)致Spastin蛋白降解，從而影響神經(jīng)元軸突中微管的正常剪切，破壞微管結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)性，進(jìn)而使依賴微管運(yùn)輸?shù)?ldquo;貨物”（線粒體等細(xì)胞器）“派送”異常，導(dǎo)致浦肯野細(xì)胞因細(xì)胞能量供應(yīng)障礙而死亡。最后，該研究團(tuán)隊(duì)從改善軸突運(yùn)輸和線粒體功能入手，發(fā)現(xiàn)抗癲癇常用藥--丙戊酸，可改善小鼠的共濟(jì)失調(diào)表型，抑制浦肯野細(xì)胞的死亡，減弱神經(jīng)炎癥，同時(shí)線粒體運(yùn)輸和功能也得到一定恢復(fù)。受到丙戊酸在SCAR20模型小鼠上良好治療效果的鼓舞，研究團(tuán)隊(duì)期望進(jìn)一步在臨床試驗(yàn)中評價(jià)丙戊酸“老藥新用”的可能性，讓SCAR20患者早日受益。另外，進(jìn)一步評價(jià)丙戊酸是否適用于其它類型的遺傳性共濟(jì)失調(diào)（尤其以浦肯野細(xì)胞死亡為特征的），也將是未來研究的一個(gè)重要方向。
SCAR20發(fā)病的分子/細(xì)胞學(xué)機(jī)制及治療示意圖
廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院助理教授張洪峰和博士生洪育娟共同完成主要實(shí)驗(yàn)工作，為文章的共同一作，王鑫教授為文章通訊作者。本研究工作得到國家自然科學(xué)基金、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、福建省自然科學(xué)基金、廈門大學(xué)校長基金的資助和支持。
九游會(huì)j9生物有幸提供實(shí)驗(yàn)中使用的質(zhì)粒構(gòu)建及病毒包裝服務(wù)，用實(shí)際行動(dòng)助力中國腦科學(xué)的發(fā)展。
原文鏈接：https://academic.oup.com/nsr/advance-article/doi/10.1093/nsr/nwab024/6132275
參考文獻(xiàn)
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九游會(huì)j9生物一直致力為神經(jīng)科學(xué)研究提供整體研究方案，從標(biāo)記、示蹤、基因操作、生理操作到觀察，提供病毒包裝、動(dòng)物模型構(gòu)建、病理研究等一站式服務(wù)。用實(shí)際行動(dòng)助力中國腦科學(xué)的發(fā)展！
