最近科研界什么比較流行？外泌體（Exosomes）是當之無愧的熱點話題。不論在腫瘤領域、神經科學領域還是代謝領域，都有大量的外泌體相關文章發(fā)表，以探究外泌體的功能和機制。
要研究外泌體的功能，一般都會在細胞和動物水平分別進行驗證，這個過程勢必涉及到外泌體的示蹤（標記），九游會j9這次綜合多篇文獻，整理了外泌體示蹤用到的方法。此外，有很多研究者對外泌體的動物注射用量也有較多疑問，這次一并整理給大家做參考。
外泌體示蹤：
1. 親脂性染料標記
目前已發(fā)表的外泌體文章中，外泌體大多使用親脂性染料進行標記，體內和體外都有較多應用。親脂性染料主要分為兩大類，第一類是PKH67（綠色熒光）/PKH26（紅色熒光），由于它們可以與外泌體的脂質雙層膜穩(wěn)定結合，所以染色效果較好，應用較廣泛。
圖1 PKH67標記的外泌體與神經元之間相互作用
Acta Neuropathol Commun. 2018 Feb 15;6(1):10.
圖2 PKH26標記的外泌體與MDA‐MB‐231細胞共培養(yǎng)
Cancer Sci. 2019 Oct;110(10):3173-3182.
第二類是Di系列的親脂性染料，包括DiI（橙色熒光）、DiO（綠色熒光）、DiD（紅色熒光）、DiR（深紅色熒光）。其中DiR的紅外熒光可穿透細胞和組織，在活體成像中用來示蹤。
圖3 DiI標記的外泌體通過靜脈注射觀察在體內器官的分布情況
J Cereb Blood Flow Metab. 2018 May;38(5):767-779.
圖4 DiO標記的外泌體與HCT116細胞共孵育
BMC Cancer. 2018 Jan 6;18(1):47.
圖5 DiR標記的外泌體靜脈注射小鼠結腸癌腫瘤模型
J Nanobiotechnology. 2020 Jan 9;18(1):10.
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2.慢病毒介導CD63-GFP表達
將外泌體的特定蛋白CD63和綠色熒光蛋白GFP的表達元件構建成質粒再包裝到慢病毒中，隨后用此慢病毒感染細胞，使細胞分泌的外泌體帶有綠色熒光。
圖6 用GFP標記的外泌體分別與SH-SY5Y、BV2和DRG細胞共培養(yǎng)
Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.
圖7 注射有CD63-GFP的外泌體后觀察第1天(D1)和第5天(D2)的熒光
Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.
3.用金納米顆粒（Gold nanoparticles，GNPs）標記
將金納米顆粒標記的外泌體通過鼻內給藥不僅能進行無創(chuàng)跟蹤，而且能促進外泌體在腦部的積累和延長在病變區(qū)域的存在時間，增強體內神經成像的效果。因此，這種外泌體標記技術可以作為多種腦疾病的強大診斷工具，并可能增強基于外泌體的神經恢復治療。
圖8 金納米顆粒外泌體的制備及體內注射
ACS Nano. 2017 Nov 28;11(11):10883-10893.
圖9 用金納米顆粒和PKH26對外泌體進行雙標記
ACS Nano. 2017 Nov 28;11(11):10883-10893.
4.用近紅外（NIR）熒光探針進行標記
這是一種使用兩親性探針對NIR熒光標記的外泌體進行內源性檢測的方法，無需對外泌體進行免疫標記或合成或色譜處理。由于NIR波長的熒光探針能穿透體內組織，從而提供了從細胞直接轉換到體內使用的好處。
圖10 未標記外泌體和NIR標記外泌體的原子力顯微鏡圖片
Chem Commun (Camb). 2018 Jun 26;54(52):7219-7222.
5.用Gaussia luciferase（gluc）和截斷的lactadherin標記
將gLuc-lactadherin構成融合表達的質粒，再將此質粒轉染細胞，使細胞分泌的外泌體帶有強的螢光素酶活性。將標記的外泌體進行靜脈注射入小鼠體內，看外泌體在組織的分布情況。
圖11 將表達了gluc-lactadherin的外泌體靜脈注射入Balb/c小鼠
J Biotechnol. 2013 May 20;165(2):77-84.
小結1
外泌體標記對探究外泌體的功能是必不可少的一個步驟，首先需要觀察到外泌體被受體細胞吸收或到達目的組織、器官，再檢測受體細胞、組織或器官中相應指標的變化，看外泌體是否具有一定的功能。確定外泌體具有功能后，再通過高通量測序或基因芯片進行差異表達分子的挖掘，進一步深入研究機制。
外泌體的動物注射用量總結
案例1：
外泌體來源：間充質干細胞
標記方式：C5 Maleimide-Alexa 594
注射方式：腦室注射
注射用量：每只小鼠1.5mg/ml、20ul
觀察部位：海馬
炎癥反應檢測時間：4 days
文章來源：Mesenchymal stem cell-derived exosomes as a nanotherapeutic agent for amelioration of inflammation induced astrocyte alterations in mice
案例2：
外泌體來源：巨噬細胞
標記方式：PKH26
注射方式：靜脈注射
注射用量：每只小鼠30ug，每7days注射一次
觀察部位：肝臟、脂肪組織、肌肉
葡萄糖、胰島素檢測時間：12 days
文章來源：Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity
案例3：
外泌體來源：血清
標記方式：PKH67
注射方式：靜脈注射
注射用量：每只小鼠約3-5*10的10次方particles/ml，200ul
觀察部位：肺部
肺部炎癥反應檢測時間：24 h
文章來源：Peripheral Circulating Exosome-Mediated Delivery of miR-155 as a Novel Mechanismfor Acute Lung Inflammation
案例4：
外泌體來源：CAR-T細胞
標記方式：NHS-Rhodamine (Rho)
注射方式：靜脈注射
注射用量：每只小鼠100-150ug，每周注射一次
觀察部位：腫瘤組織
抗腫瘤活性檢測時間：5-40 days
文章來源：CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity
小結2：
動物的外泌體注射可以采用定位注射和靜脈注射等，不同注射方法外泌體的用量不同，此外，不同的外泌體來源用到的外泌體量也不同，建議在做動物注射正式實驗之前，可以先做個預實驗，摸索合適的外泌體用量，一方面既可以展現(xiàn)外泌體的功能，另一方面也可以確保動物的存活率。
