收集菌體有兩種方式：1）離心；2）中空纖維切向流過(guò)濾。離心操作在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中難以放大；而中空纖維有開放式的通道，能夠處理高固含量（大腸桿菌發(fā)酵液）、高粘度（菌體裂解液）和剪切力敏感型樣品（質(zhì)粒），并且具有良好的線性放大能力。在這一步推薦使用750kD或0.1-0.2um的1 mm內(nèi)徑的中空纖維進(jìn)行菌體的收集和清洗。

 

菌體裂解方法有很多，常用的是堿裂解，由Birnboim和Doly最早提出（Birnboim HC, Doly J. Nucleic Acids Res 1979;7(6):1513–23.）。在堿性條件下，大腸桿菌的蛋白質(zhì)、RNA、宿主DNA和質(zhì)粒釋放至溶液中并變性。加入中和液后，大量變性的蛋白質(zhì)和宿主DNA被沉淀，而質(zhì)粒由于分子量較小，很容易復(fù)性并保留在溶液中。

 

當(dāng)溶液I、II和III相繼加完后，裂解液體積會(huì)變得非常大，在層析純化前進(jìn)行濃縮和洗濾，不僅可以大大減小樣品體積，還可以有效去除RNA、色素和部分宿主蛋白、宿主DNA等雜質(zhì)，減少層析階段的負(fù)荷。對(duì)于質(zhì)粒的超濾濃縮，一般按照如下表格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行NWMC的選擇，中空纖維的低剪切力特點(diǎn)可以有效保護(hù)質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象。此外，平板膜包也可以用于本步超濾濃縮，但是根據(jù)不同質(zhì)粒的大?，MWCO的選擇可能與中空纖維的略有差異。

經(jīng)過(guò)超濾濃縮后，樣品中主要雜質(zhì)有RNA殘留、開環(huán)DNA和內(nèi)毒素。針對(duì)這三種雜質(zhì)，通過(guò)以下三步層析一一去除。

1）凝膠過(guò)濾層析

凝膠過(guò)濾層析的目的是去除大量RNA殘留。高濃度硫酸銨（≥1.5 M硫酸銨）的平衡液使RNA和質(zhì)粒的空間大小的差異性達(dá)到了最大，質(zhì)粒通過(guò)層析柱的外水體積首先流出。組群分離（Group separation）模式使其上樣體積達(dá)到了0.3CV。本步層析以后，質(zhì)粒已經(jīng)達(dá)到了很高的純度，瓊脂糖凝膠電泳幾乎看不到RNA雜帶，見如下電泳圖所示。

2）親和層析

親和層析的主要目的是去除開環(huán)質(zhì)粒。凝膠過(guò)濾得到的質(zhì)粒被置換到高濃度硫酸銨的緩沖液，可以直接上樣至親和層析柱，在此條件下，開環(huán)和超螺旋質(zhì)粒均與填料結(jié)合；上樣結(jié)束后，首先用2.0 M硫酸銨的緩沖液沖洗開環(huán)質(zhì)粒；然后用含1.7 M硫酸銨和0.3 M氯化鈉的緩沖液將超螺旋質(zhì)粒洗脫，實(shí)現(xiàn)開環(huán)質(zhì)粒與超螺旋質(zhì)粒的分離。
 

3）陰離子交換層析

經(jīng)過(guò)前兩步層析，質(zhì)粒的純度和均一性（超螺旋比例）達(dá)到了新高度，最后一步層析重點(diǎn)是去除內(nèi)毒素。來(lái)源于大腸桿菌，內(nèi)毒素始終是質(zhì)粒的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)雜質(zhì)。市面上無(wú)內(nèi)毒質(zhì)粒抽提試劑盒，其內(nèi)毒素能達(dá)到的標(biāo)準(zhǔn)也只有＜100 EU/mg質(zhì)粒。

       質(zhì)粒帶有高密度的負(fù)電荷，能夠在高鹽濃度下與強(qiáng)陰離子交換填料結(jié)合。將親和層析洗脫液用水稀后，可以上樣至陰離子層析柱，而內(nèi)毒素在此高鹽情況下不與填料結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)去內(nèi)毒的功能。經(jīng)過(guò)此步，內(nèi)毒素含量可降至＜1 EU/mg。

同裂解液的超濾濃縮一樣，使用中空纖維或平板膜包，將質(zhì)粒濃縮換液至制劑緩沖液中，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)粒一般換液至Buffer TE中。

 

對(duì)該質(zhì)粒三步層析中間樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下表所示。可見，經(jīng)過(guò)三步層析后，超螺旋質(zhì)粒純度大于90%，內(nèi)毒素和宿主DNA殘留分別小于10 EU/mg和2 μg/mg。

以上為九游會(huì)j9生物GMP平臺(tái)成立以來(lái)，基于層析的某質(zhì)粒純化工藝案例分享。質(zhì)粒的高質(zhì)量和高純度是確：笮闃柿；蠆《駒靨灝踩院陀行緣那疤，是工業(yè)化生產(chǎn)步驟重要環(huán)節(jié)之一。

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