2020年7月，華東師范大學生命學院葉海峰研究員團隊在雜志《Nature Communications》上發(fā)表了題為“A non-invasive far-red light-induced split-Cre recombinase system for controllable genome engineering in mice”(原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32709899/)研究成果。該研究構(gòu)建了一種基于遠紅外光誘導的裂解Cre-loxP體系，實現(xiàn)了利用遠紅外光對體內(nèi)基因進行調(diào)控的目的。

由于Cre-loxP重組體系能夠有效克服其他類型重組技術的非特異性或重組效率低等缺點，近年已逐漸在功能基因研究領域占據(jù)主導地位。Cre-loxP技術和化學誘導結(jié)合，可以實現(xiàn)基因重組的時間特異性，然而，化學誘導的Cre-loxP具有細胞毒性、泄漏、脫靶等劣勢，例如心血管研究中常用的tamoxifen誘導的Cre-loxP體系，tamoxifen可能會產(chǎn)生心功能障礙等癥狀[1]，影響研究結(jié)果。與化學誘導體系相比較，光遺傳學避免部分了化學誘導體系的劣勢。但是，UV誘導的Cre-loxP體系[2]仍具有細胞毒性；藍光誘導的CRY2-Cre體系[3]，因其穿透組織能力較差、重組效率低等問題，所以在體內(nèi)研究應用的過程中仍具有局限性。遠紅外光和近紅外輻射能夠有效的滲透到組織和器官中[4]。

葉海峰研究員團隊基于split-Cre重組系統(tǒng)和遠紅外光(FRL)可誘導光遺傳系統(tǒng)建立了遠紅外光誘導的split Cre-loxP體系(FISC，far-red light-induced split Cre-loxP system)。在該體系中，Cre酶被分為兩個片段，N端Cre融合到一個Coh2結(jié)構(gòu)，融合表達CreN-Coh2蛋白;C端Cre融合到一個DocS結(jié)構(gòu)，融合表達DocS-CreC蛋白;在FRL光照條件下， Coh2和DocS在強親和力的作用下結(jié)合，從而Cre酶也被重新組合[5]。該體系，具有本底滲透低，無明顯細胞毒性，重組效率高，時間可控性等特點。實現(xiàn)了條件性非侵入的基因調(diào)控目的，為生物研究和治療提供了一種有效的工具。

基于對Cre酶的結(jié)構(gòu)分析，將Cre酶CreN59/CreC60分離，構(gòu)建FISC系統(tǒng)(圖1a)。在FRL光照條件下，DocS-CreC60融合表達與Coh2-CreN59結(jié)合，Cre酶2個片段重新組合，可以切除2個loxP位點間的DNA序列(圖1b)。為了降低背景的影響，提高DNA重組效率構(gòu)建了3個FRL應答的啟動子PFRLx(圖1c)，并對不同啟動子的啟動效果進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TATA啟動子的控制條件下，DocS-CreC60的光誘導重組效率更好(圖1d)；4個質(zhì)粒比列為10:1:1:20時共轉(zhuǎn)染HEK293細胞時，F(xiàn)RL誘導的DNA重組效率最高(圖1e)；L9/L9鏈接方式在FRL誘導時DNA重組效率最高(圖1f)。

為了證明在哺乳動物細胞中對Cre酶活性的作用，在HEK-293細胞轉(zhuǎn)染FISC質(zhì)：痛衛(wèi)oxP位點的綠色熒光蛋白(EGFP)或熒光素報告酶(Luciferase reporter)基因，結(jié)果表明，具有FISC的細胞在FRL作用下發(fā)生重組，無FRL時基因重組水平極低(圖2a, b)，且DNA重組的效率與FRL光照強度和光照時間呈現(xiàn)正相關關系(圖2c, d)。除了HEK-293細胞外，F(xiàn)ISC也可以激活其他細胞的基因重組(圖2e)，利用光掩膜控制FRL照射的空間區(qū)域(圖2f)，證明了該系統(tǒng)的高空間分辨性。FISC系統(tǒng)中，F(xiàn)RL沒有明顯的細胞毒性且具有更高效的DNA重組。

接下來對FISC系統(tǒng)能否在動物體內(nèi)發(fā)揮作用進行探究。小鼠尾靜脈高壓注射3個質(zhì)粒的FISC系統(tǒng)，8h后FRL照射小鼠腹腔，結(jié)果顯示，F(xiàn)RL照射12h表現(xiàn)出高熒光素酶活性(圖3a, b)。同時對不同的光誘導系統(tǒng)進行比較發(fā)現(xiàn)，攜帶FISC系統(tǒng)的小鼠，光照后熒光素酶活性明顯高于其他系統(tǒng)圖(圖3b, c)。

AAV載體作為生物研究和臨床治療的首選病毒載體，具有較低的免疫原性和致癌風險。為了使該系統(tǒng)在未來的疾病治療中具有更為廣闊的應用前景，因此研究人員通過AAV載體將FISC系統(tǒng)導入tdTomato小鼠。由于AAV載體的容量限制，所以將FISC系統(tǒng)重新設計3個AAV病毒載體(圖4a)。將3個病毒載體混合通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)(圖4b, c)，3周后熒光成像顯示暴露于FRL下的小鼠比未暴露于FRL下的小鼠基因轉(zhuǎn)導效率增加17.7倍(圖4d, e)，并且檢測發(fā)現(xiàn)肝臟中信號最強(圖4f, g)，對肝臟組織進行qRT-PCR和WB分析(圖4h, i)，AAV載體介導的FISC系統(tǒng)在FRL照射條件下基因表達水平和蛋白表達水平均顯著增高，肝臟組織切片結(jié)果也證明了FRL誘導下表達增加(圖4j)。以上結(jié)果表明，與其他兩種給要方式相比，AAV藥物治療FISC系統(tǒng)在體內(nèi)表現(xiàn)出更高的性能，具有作為一種臨床治療方案潛在發(fā)展前景。

FISC系統(tǒng)可通過AAV在動物體內(nèi)實現(xiàn)高效的基因重組，能夠進行條件性的基因操作，并且具有良好的時間可控性、高滲透性、低毒性和低侵襲性的特點。因此，F(xiàn)ISC系統(tǒng)可用于多領域的基因編輯工作。