通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒對干細(xì)胞或T細(xì)胞進(jìn)行基因改造的體外基因治療，在治療免疫缺陷和癌癥上有顯著療效，但是這一過程成本高昂，技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性，不容易被廣泛使用。直接的體內(nèi)基因治療可以避免這些問題，且腺相關(guān)病毒（AAV）載體在臨床試驗(yàn)中已被證明是安全有效的。然而，系統(tǒng)給藥后體內(nèi)AAV對淋巴細(xì)胞的感染能力如何尚未被仔細(xì)研究。

本文[1]作者用標(biāo)準(zhǔn)的AAV8和外泌體相關(guān)的AAV8載體（exo-AAV8）分別對小鼠進(jìn)行系統(tǒng)給藥，發(fā)現(xiàn)兩種方法都能有效地感染大量的免疫細(xì)胞群，包括CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。通過檢測AAV基因組和遞送基因的mRNA，提供了細(xì)胞被感染的直接證據(jù)。本文建立了AAV介導(dǎo)體內(nèi)基因遞送到免疫細(xì)胞的可行性，這將促進(jìn)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究朝著體內(nèi)基因免疫治療的目標(biāo)發(fā)展。

1. 在成年小鼠中系統(tǒng)遞送AAV8和exo-AAV8載體后免疫細(xì)胞中GFP的表達(dá)

之前有報(bào)道表明，與傳統(tǒng)的AAV載體相比，外泌體相關(guān)的AAV（exo-AAV）載體在小鼠體內(nèi)介導(dǎo)了更高的靶器官感染效率。為了確定這些載體在系統(tǒng)遞送時(shí)是否能介導(dǎo)免疫細(xì)胞的體內(nèi)感染，作者給C57BL/6小鼠靜脈注射了3*10的12次方genome copies的exo-AAV8（AAV-sc-CBA-GFP）（Fig.1A），用PBS作為對照組。注射21天后，作者從脾臟、淋巴結(jié)和肝臟中分離免疫細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測GFP在CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)（Fig.1B-D）。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在脾臟和淋巴結(jié)中，CD4+T細(xì)胞中GFP表達(dá)為6.2-6.4%，CD8+T細(xì)胞中GFP表達(dá)為8.2-8.8%，B細(xì)胞中GFP表達(dá)為2.5-2.6%，巨噬細(xì)胞中GFP表達(dá)為5.9-6.9%，樹突狀細(xì)胞中GFP表達(dá)為6.8-7.0%。值得注意的是，肝臟中所有5種細(xì)胞類型的表達(dá)程度都明顯較高，GFP陽性細(xì)胞的百分比在32.6-38.7%之間。

為了研究基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)，作者給小鼠注射9.1*10的11次方gc的exo-AAV8-sc-CBA-GFP，并在注射后第3天、7天、14天、21天和28天從血液中分析免疫細(xì)胞。結(jié)果顯示，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中GFP陽性細(xì)胞的百分比在第14天達(dá)到高峰，并在28天后緩慢下降。B細(xì)胞的感染效率在第3天時(shí)達(dá)到高峰，2周內(nèi)保持穩(wěn)定，28天時(shí)略有下降。

 

為了直接比較傳統(tǒng)AAV載體與exo-AAV載體的感染效率，作者給小鼠注射了相同劑量的含有相同sc-CBA-GFP結(jié)構(gòu)的載體。如Fig.3所示，兩種載體在選定的免疫細(xì)胞中介導(dǎo)了相似的感染水平，而傳統(tǒng)的AAV在某些細(xì)胞中產(chǎn)生的比例略高。

為了提供更多exo-AAV8直接感染免疫細(xì)胞的證據(jù)，作者從第12天小鼠的脾臟中分選了CD4+和CD8+T細(xì)胞，并用qPCR從AAV基因組中分離DNA來檢測GFP cassette，以及用qRT-PCR檢測GFP mRNA。對于CD4+和CD8+T細(xì)胞，作者發(fā)現(xiàn)在exo-AAV8-GFP注射的小鼠中，AAV基因組的水平比PBS注射的對照組中高6.4和5.8倍（Fig.4A）。同樣，作者在注射exo-AAV8-GFP的小鼠中檢測到GFP cDNA水平分別高6.0和3.4倍（Fig.4B）。這些數(shù)據(jù)表明，系統(tǒng)注射exo-AAV8載體可以介導(dǎo)體內(nèi)免疫細(xì)胞的感染。

2. 系統(tǒng)注射exo-AAV8載體后淋巴細(xì)胞的表面表達(dá)了人源的IL-2Rα

作者構(gòu)建了一個(gè)編碼人白細(xì)胞介素-2受體α鏈（IL-2Rα）又稱CD25的sc AAV質(zhì)粒，并且得到了exo-AAV8-sc-CBA-hCD25載體（Fig.5A）。隨后給小鼠靜脈注射1*10的12次方gc的exo-AAV8-sc-CBA-hCD25或PBS作為對照。注射后第12天，用流式細(xì)胞術(shù)檢測血液、脾臟、淋巴結(jié)和肝臟中的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞的hCD25 （hCD25）表達(dá)（Fig.5B，C）。

 

 

作者對exo-AAV8載體應(yīng)用于體內(nèi)的效果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)將exo-AAV8系統(tǒng)注射小鼠后能有效感染脾臟、淋巴結(jié)和肝臟中的免疫細(xì)胞，如CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。此外，除了本文提及的結(jié)果，exo-AAV載體應(yīng)用在體內(nèi)遞送還可以引入其他開發(fā)的潛力，包括降低宿主抗體對AAV顆粒的識(shí)別以及通過用相關(guān)配體修飾外泌體來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞靶向策略的前景等。

 

參考文獻(xiàn)：

[1] Sci Rep. 2020 Mar 11;10(1):4544.  doi: 10.1038/s41598-020-61518-w. In vivo engineering of lymphocytes after systemic exosome-associated AAV delivery.

 

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