乳腺癌已成為全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，也是女性最常見的癌癥。大約20%的乳腺癌患者HER-2過表達(dá)，因此預(yù)后較差。目前，靶向HER-2胞外區(qū)域的人源化單克隆抗體曲妥珠單抗已是HER-2陽性乳腺癌的替代治療方案。然而，只有一小部分轉(zhuǎn)移性患者對(duì)曲妥珠單抗有反應(yīng)，大約60%的患者在最初反應(yīng)后產(chǎn)生耐藥性。
外泌體是一種釋放到組織液中且大小為20-150nm的具膜小泡，小泡中含有來自供體細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、編碼和非編碼RNAs，這些分子可以被其他細(xì)胞所攝取。有文獻(xiàn)報(bào)道，有些lncRNAs在乳腺癌曲妥珠單抗耐藥過程中起重要作用。然而，外泌體包裹的lncRNAs是否參與了耐藥作用尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。
近日，海南省人民醫(yī)院和鄭州大學(xué)附屬第一醫(yī)院共同在《Molecular Cancer》上發(fā)表論文，闡述了外泌體lncRNA（AFAP1-AS1）可以與AUF1結(jié)合，促進(jìn)ERBB2翻譯，從而誘導(dǎo)曲妥珠單抗耐藥。
九游會(huì)j9生物可提供從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、外泌體分離、外泌體鑒定、外泌體高通量檢測、外泌體示蹤到體內(nèi)外功能驗(yàn)證的整體服務(wù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1.LncRNA AFAP1-AS1在曲妥珠單抗細(xì)胞中上調(diào)并被H3K27ac激
作者首先建立了乳腺癌的曲妥珠單抗耐藥株（SKBR-3-TR和BT474-TR），再將SKBR-3-TR和SKBR-3親本細(xì)胞進(jìn)行高通量測序，根據(jù)火山圖、表達(dá)倍數(shù)變化等生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1在這兩種類型細(xì)胞中顯著失調(diào)。隨后，作者用qRT-PCR驗(yàn)證了AFAP1-AS1在乳腺癌耐藥細(xì)胞系中的水平，結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞系中的AFAP1-AS1水平顯著上調(diào)。同時(shí)，HER-2陽性乳腺癌組織中AFAP1-AS1水平比HER-2陰性乳腺癌組織也明顯升高。
隨后作者通過表觀遺傳修飾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在AFAP1-AS1啟動(dòng)子區(qū)域大量富集組氨酸乙?；℉3K27ac）。此外，曲妥珠單抗處理顯著增加了親代乳腺癌細(xì)胞H3k27ac的富集水平。總之，AFAP1-AS1在曲妥珠單抗細(xì)胞中呈現(xiàn)上調(diào)，主要是因?yàn)樵贏FAP1-AS1啟動(dòng)子區(qū)域H3K27ac富集增加（Fig.1）。
Fig.1 LncRNA AFAP1-AS1在曲妥珠單抗細(xì)胞中上調(diào)并被H3K27ac激活
2.干擾lncRNA AFAP1-AS1可以逆轉(zhuǎn)曲妥珠單抗的耐藥性
作者對(duì)AFAP1-AS1進(jìn)行干擾后，通過CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1敲低會(huì)顯著增加曲妥珠單抗對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用。此外，EdU染色和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明了敲低AFAP1-AS1也明顯降低了細(xì)胞增殖和減少細(xì)胞活力。
隨后作者進(jìn)一步考察了AFAP1-AS1過表達(dá)對(duì)SKBR-3和BT474親本細(xì)胞曲妥珠單抗的耐藥性影響。實(shí)驗(yàn)表明，提高AFAP1-AS1可以消除曲妥珠單抗處理引起的細(xì)胞死亡，此外，AFAP1-AS1過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移能力（Fig.2）。
Fig.2AFAP1-AS1敲低能逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的曲妥珠單抗耐藥性
3.LncRNA AFAP1-AS1水平與HER-2陽性乳腺癌患者的曲妥珠單抗耐藥性相關(guān)
作者用qRT-PCR檢測了64個(gè)HER-2陽性患者組織樣本的AFAP1-AS1表達(dá)水平，其中有32例曲妥珠單抗耐藥患者和32例曲妥珠單抗反應(yīng)患者。結(jié)果表明，曲妥珠單抗耐藥患者中AFAP1-AS1水平比敏感患者顯著上調(diào)。作者發(fā)現(xiàn)，無反應(yīng)患者血清中的AFAP1-AS1水平比有反應(yīng)患者的明顯提高。此外，Kaplan-Meier分析顯示，曲妥珠單抗治療的乳腺癌患者在接受治療前，其血清內(nèi)具有高水平AFAP1-AS1，且與PFS和OS降低相關(guān)（Fig.3）。
Fig.3高水平AFAP1-AS1與接受曲妥珠單抗治療的乳腺癌患者的不良反應(yīng)有關(guān)
4.胞外AFAP1-AS1通過裝入外泌體中進(jìn)行傳遞
作者用AFAP1-AS1探針進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，AFAP1-AS1主要分布在曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，這意味著AFAP1-AS1可能被包裹外泌體中進(jìn)行分泌。接著，作者用RNAse和Triton×100處理細(xì)胞培養(yǎng)上清，發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1釋放時(shí)用膜包裹而不是直接釋放。隨后，作者分離細(xì)胞培養(yǎng)上清中的外泌體，通過TEM、NTA和WB實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，表明分離出的外泌體具有典型的膜狀結(jié)構(gòu)、直徑大小在30-150nm，且蛋白TSG101和CD81在外泌體中的大量富集。此外，通過對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清和外泌體中的AFAP1-AS1進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)外泌體是胞外AFAP1-AS1分泌的主要載體。同時(shí)，作者觀察到曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞的培養(yǎng)上清中AFAP1-AS1水平明顯比敏感細(xì)胞高。
為了了解AFAP1-AS1如何包裹到外泌體中，作者通過RIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了AFAP1-AS1與HNRNPA2B之間相互作用。再將HNRNPA2B進(jìn)行干擾或過表達(dá)后，AFAP1-AS1水平分別呈現(xiàn)降低或增高。這些結(jié)果表明AFAP1-AS1以一種依賴HNRNPA2B1的方式被特異性包裹入外泌體(Fig.4)。
Fig.4 胞外AFAP1-AS1通過包裹入外泌體進(jìn)行傳遞
5.外泌體介導(dǎo)的AFAP1-AS1傳遞可傳播曲妥珠單抗耐藥
作者從SKBR-3-TR細(xì)胞上清中分離外泌體，并用PKH26染料進(jìn)行標(biāo)記，再與SKBR-3和BT474共孵育48h，結(jié)果顯示，受體細(xì)胞有強(qiáng)烈的紅色信號(hào)，表明受體細(xì)胞能很好地吞噬外泌體。隨后，提取受體細(xì)胞質(zhì)中的RNA用qRT-PCR檢測，作者發(fā)現(xiàn)與外泌體共孵育后，受體細(xì)胞中的AFAP1-AS1水平顯著升高，這說明了外泌體中的AFAP1-AS1能夠傳遞到受體細(xì)胞中。
作者進(jìn)一步研究了外泌體遞送的AFAP1-AS1是否能同時(shí)將耐藥表型傳遞給受體細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用SKBR-3-TR來源的外泌體孵育的親本細(xì)胞對(duì)曲妥珠單抗的敏感性降低。再用外泌體分泌抑制劑GW4869處理SKBR-3-TR細(xì)胞，用處理后的SKBR-3-TR上清與親本細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)上清沒有將曲妥珠單抗耐藥性傳遞給受體細(xì)胞。同時(shí)，敲低AFAP1-AS1和HNRNPA2B1能抑制共培養(yǎng)的親本細(xì)胞獲得曲妥珠單抗耐藥的能力（Fig.5）。
Fig.5外泌體介導(dǎo)的lncRNA AFAP1-AS1轉(zhuǎn)移能誘導(dǎo)曲妥珠單抗耐藥性
6.AFAP1-AS1通過上調(diào)HER-2表達(dá)誘導(dǎo)曲妥珠單抗耐藥性
作者通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)與親本細(xì)胞相比，HER-2蛋白在SKBR-3-TR和BT474-TR細(xì)胞中是上調(diào)的。在曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞中，敲低AFAP1-AS1能降低HER-2表達(dá)，但是用qRT-PCR檢測ERBB2（ERBB2用于指示HER-2蛋白的編碼RNA）表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1對(duì)ERBB2水平影響不顯著。此外，過表達(dá)AFAP1-AS1能上調(diào)HER-2蛋白水平而ERBB2水平不受影響?？傊?，作者證實(shí)了AFAP1-AS1在曲妥珠單抗耐藥和HER-2表達(dá)上調(diào)中的作用，然而，AFAP1-AS1/HER-2信號(hào)軸是否參與了曲妥珠單抗耐藥還有待進(jìn)一步證實(shí)（Fig.6）。
Fig.6 乳腺癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA AFAP1-AS1能調(diào)節(jié)HER-2蛋白水平
7.LncRNA AFAP1-AS1與AUF1結(jié)合發(fā)揮關(guān)鍵作用
作者通過RNA-FISH和細(xì)胞分級(jí)PCR可以分析出，AFAP1-AS1主要分布在曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，這揭示了AFAP1-AS1可能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路。作者通過最小自由能（MFE）評(píng)估，發(fā)現(xiàn)在911-1190nt位點(diǎn)的AFAP1-AS1轉(zhuǎn)錄本形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這對(duì)于靶向RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合至關(guān)重要。隨后，通過RNA pulldown實(shí)驗(yàn)作者鑒定出了AUF1蛋白，它能夠結(jié)合到目標(biāo)mRNA的3’非翻譯區(qū)（UTR）并促進(jìn)其翻譯而不影響mRNA水平。免疫熒光檢測出AUF1和AFAP1-AS1在細(xì)胞質(zhì)中共表達(dá)。通過AFAP1-AS1探針設(shè)計(jì)和RNA pull-down實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)AUF1蛋白被AFAP1-AS1大量富集。此外，RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了AFAP1-AS1可由AUF1沉淀下來。AUF1在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上均不受AFAP1-AS1敲低的影響。這些結(jié)果表明了AFAP1-AS1能與AUF1蛋白結(jié)合，發(fā)揮重要的生物功能（Fig.7）。
Fig.7AFAP1-AS1與AUF1相互作用，從而激活了ERBB2的翻譯
8.敲低AFAP1-AS1可以逆轉(zhuǎn)曲妥珠單抗耐藥和體內(nèi)轉(zhuǎn)移
作者先將SKBR-3-TR和BT474-TR細(xì)胞感染了sh-AFAP1-AS1或sh-NC，構(gòu)建了干擾的穩(wěn)定株，再將穩(wěn)定株皮下注射入裸鼠中，形成干擾的動(dòng)物模型，隨后進(jìn)行曲妥珠單抗腹腔治療。將20天后裸鼠中的腫瘤剝離并分成不同組，結(jié)果顯示，sh-AFAP1-AS1組形成的腫瘤明顯比對(duì)照組小。通過IHC檢測發(fā)現(xiàn)由sh-AFAP1-AS1感染細(xì)胞形成的腫瘤，其HER-2表達(dá)水平低于由對(duì)照組形成的腫瘤。
作者將感染了sh-AFAP1-AS1的SKBR-3-TR穩(wěn)定株通過尾靜脈注射入裸鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由sh-AFAP1-AS1穩(wěn)定株產(chǎn)生的螢光素酶計(jì)量和肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)明顯少于由sh-NC細(xì)胞形成的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)。與正常肺組織相比，HE染色肺組織轉(zhuǎn)移灶陽性區(qū)域明顯改善?？傊?，作者驗(yàn)證了干擾AFAP1-AS1后可逆轉(zhuǎn)妥珠單抗耐藥性和乳腺癌的體內(nèi)轉(zhuǎn)移（Fig.8）
文章結(jié)論：
作者從曲妥珠單抗耐藥株用lncRNA芯片篩選出高表達(dá)的lncRNA AFAP1-AS1，再通過功能獲得和缺失實(shí)驗(yàn)揭示了敲低AFAP1-AS1能逆轉(zhuǎn)曲妥珠單抗耐藥性。此外，細(xì)胞外的AFAP1-AS1能與外泌體結(jié)合，傳遞曲妥珠單抗耐藥性。機(jī)制上，AFAP1-AS1通過與AUF1結(jié)合提高ERBB2 mRNA的翻譯，從而誘導(dǎo)HER-2蛋白水平的上調(diào)，進(jìn)而引起曲妥珠單抗耐藥性（Fig.9）。
Fig.9 曲妥珠單抗耐藥傳遞的機(jī)制
九游會(huì)j9生物一直致力為外泌體研究提供整體解決方案，從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、外泌體分離、外泌體鑒定、外泌體分子檢測到外泌體示蹤和體內(nèi)外功能驗(yàn)證，豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)、專業(yè)的科研團(tuán)隊(duì)、優(yōu)質(zhì)的技術(shù)支持服務(wù)，為您的項(xiàng)目保駕護(hù)航！
參考文獻(xiàn)：
Mol Cancer. 2020; 19: 26. Exosome-mediated lncRNA AFAP1AS1 promotes trastuzumab resistance through binding with AUF1 and activating ERBB2 translation.
