膀胱癌（BCa）作為全球最常見的惡性腫瘤之一，是男性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，2018年估計(jì)新增55萬病例和2萬人死亡。BCa患者的預(yù)后與淋巴結(jié)（LN）轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其5年生存率從77.6%下降到18.6%，但是BCa中引發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍不清楚。
研究報(bào)道由腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）產(chǎn)生的VEGF-C在BCa淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起重要作用。此外，PROX1對淋巴管系統(tǒng)的形成、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的分化和誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的淋巴出芽和延伸也起到關(guān)鍵作用。然而，癌細(xì)胞促進(jìn)淋巴管生成和PROX1上調(diào)的確切機(jī)制仍需要進(jìn)一步探究。
外泌體是一類粒徑大小為30-150nm的微小囊泡，內(nèi)容物含有各種核酸組分，包括mRNAs、miRNAs、lncRNAs。最近有研究表明癌癥細(xì)胞分泌的外泌體是細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵信使，與癌癥引起的血管通透性、炎癥等相關(guān)。
近日，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院的林天歆課題組報(bào)道了一種lncRNA，LINC00858，被稱為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物2（LNMAT2），在BCa組織中過表達(dá)，同時(shí)也在BCa患者的尿液外泌體（urinary-EXO）中大量富集，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。外泌體LNMAT2能在體內(nèi)外促進(jìn)淋巴管生成和LN轉(zhuǎn)移。機(jī)制上，裝載到外泌體中的LNMAT2與異質(zhì)核糖核蛋白A2B1（hnRNPA2B1）直接相互作用，并被傳遞到人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（HLECs）。隨后，LNMAT2通過誘導(dǎo)hnRNPA2B1介導(dǎo)的H3賴氨酸4三甲基化（H3K4me3）與PROX1啟動子形成三聚體，增強(qiáng)PROX1轉(zhuǎn)錄，從而BCa中促進(jìn)淋巴管生成和LN轉(zhuǎn)移。
九游會j9生物可提供從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、外泌體分離、外泌體鑒定、外泌體高通量檢測、外泌體示蹤到體內(nèi)外功能驗(yàn)證的整體服務(wù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1.LNMAT2過表達(dá)與BCa淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)
作者通過二代測序（NGS）技術(shù)分別測不同組織中的lncRNAs表達(dá)情況，即5例BCa患者中高度肌肉侵襲性膀胱癌（MIBC組織）和癌旁組織（NATs），5對LN陽性和LN陰性的BCa組織。數(shù)據(jù)分析顯示，與NATs相比，LNMAT2在MIBC組織中表達(dá)增加了3倍以上；與LN陰性組織相比，LN陽性組織中LNMAT2表達(dá)也提高了3倍以上。隨后作者用266個(gè)BCa患者的膀胱癌組織和癌旁組織進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR），結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了LNMAT2在膀胱癌組中呈現(xiàn)過表達(dá)現(xiàn)象。隨后，通過RACE、FISH等實(shí)驗(yàn)對LNMAT2的特征進(jìn)行闡述，LNMAT2位于染色體10q23.1，全長為3187nt，定位于BCa細(xì)胞的胞質(zhì)中。
此外，作者通過對266個(gè)BCa患者的檢測數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)BCa患者的LNMAT2表達(dá)與LN轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（Figure 1A）。Kaplan-Meier曲線分析揭示了LNMAT2過表達(dá)會使BCa患者有較短的總生存期(OS)和無病生存率（DFS）（Figure 1B-C）。原位雜交（ISH）結(jié)果表明LNMAT2在LN陽性的BCa組織中顯著上調(diào)，在LN陰性的BCa組織中有稍許增加，在NATs中幾乎檢測不出（Figure 1D-E）。重要的是，LNMAT2表達(dá)也與淋巴管密度呈正相關(guān)，可以用淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體1（LYVE-1）進(jìn)行觀察，但是BCa中沒有看到LNMAT2和VEGF-C表達(dá)之間的相關(guān)性（Figure 1F-H）。
Figure 1 LNMAT2過表達(dá)與BCa淋巴轉(zhuǎn)移有相關(guān)性
2.LNMAT2在BCa細(xì)胞分泌的外泌體中富集
由于胞外lncRNAs主要包裹在特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，尤其是外泌體，且在介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用和促進(jìn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面具有重要的生物學(xué)功能，故作者檢測了BCa細(xì)胞分泌的外泌體中LNMAT2表達(dá)水平。作者用qRT-PCR分析了206例BCa患者和120例健康對照者的尿液樣本中分離的外泌體，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，從BCa患者獲得的尿液EXO中LNMAT2水平上調(diào)(Figure 2A),這表明了外泌體LNMAT2對BCa的發(fā)展至關(guān)重要。
隨后作者進(jìn)一步檢測了從BCa細(xì)胞系(5637和UM-UC-3)的培養(yǎng)上清中分離的外泌體中LNMAT2的表達(dá)。為了證實(shí)從培養(yǎng)上清中分離得到的顆粒是外泌體，作者分別用透射電鏡（TEM）鑒定外泌體的杯狀形態(tài)（Figure 2B）、Nanosight分析外泌體的大。‵igure 2C）和WB檢測外泌體的特定標(biāo)志物（CD9和CD63）（Figure 2D）。在5637和UM-UC-3細(xì)胞系中LNMAT2表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)LNMAT2在BCa細(xì)胞分泌的外泌體中富集量與細(xì)胞表達(dá)量相關(guān)，這揭示了LNMAT2主要以外泌體形式發(fā)揮其作用（Figure 2E）。過表達(dá)或干擾細(xì)胞中LNMAT2的表達(dá)同時(shí)會相應(yīng)地上調(diào)或下調(diào)外泌體中LNMAT2的表達(dá)（Figure 2，H和I）?？傊?，上述結(jié)果表明了LNMAT2在BCa細(xì)胞分泌的外泌體中大量富集。
Figure 2 LNMAT2水平在BCa細(xì)胞分泌的外泌體中顯示上調(diào)
3.BCa細(xì)胞分泌的外泌體LNMAT2可在體外促進(jìn)淋巴管生成
作者將BCa細(xì)胞分泌的外泌體與HLECs細(xì)胞共孵育，檢測發(fā)現(xiàn)與對照組相比，BCa細(xì)胞分泌的外泌體能顯著促進(jìn)HLEC的成管和遷移能力（Figure3，A-C）。由過表達(dá)LNMAT2細(xì)胞分泌的外泌體能強(qiáng)烈誘導(dǎo)HLEC的成管和遷移（Figure 3，D-F），而由干擾LNMAT2細(xì)胞分泌的外泌體失去了其誘導(dǎo)HLEC的成管和遷移的能力（Figure 3，G-I）。
Figure 3 外泌體LNMAT2能在體外促進(jìn)淋巴管生成
4.外泌體LNMAT2能在體內(nèi)促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移
作者將luciferase標(biāo)記的UM-UC-3細(xì)胞移植到裸鼠的腳墊處，并把裸鼠隨機(jī)分成3組，隨后進(jìn)行瘤內(nèi)注射，3組注射劑分別為PBS（control）、轉(zhuǎn)染了空載體的UM-UC-3細(xì)胞分泌的外泌體（UM-UC-3-EXOvector）、轉(zhuǎn)染了帶有LNMAT2的UM-UC-3細(xì)胞分泌的外泌體（UM-UC-3-EXOLNMAT2）。當(dāng)原發(fā)腫瘤達(dá)到200mm3，切除腫瘤和腘窩淋巴結(jié)進(jìn)行分析（Figure 4A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組或UM-UC-3-EXOvector相比，UM-UC-3-EXOLNMAT2能顯著提高BCa細(xì)胞向LNs轉(zhuǎn)移的能力（Figure 4，B和C）。UM-UC-3-EXOLNMAT2組中腘窩淋巴結(jié)的體積也比對照組或UM-UC-3-EXOvector大（Figure 4，D和E）。螢光素酶免疫染色實(shí)驗(yàn)也表明了UM-UC-3-EXOLNMAT2組中外泌體的LNMAT2能提高BCa細(xì)胞向LNs轉(zhuǎn)移的能力（Figure 4，F(xiàn)和G）。
Figure 4 外泌體LNMAT2能在體內(nèi)促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移
隨后，作者研究了外泌體LNMAT2的體內(nèi)致瘤能力，即小鼠皮下接種UM-UC-3細(xì)胞，并將小鼠隨機(jī)分為3組，再向每組分別瘤內(nèi)注射PBS、UM-UC-3-EXOvector和UM-UC-3-EXOLNMAT2，每3天注射一次，連續(xù)5周（Figure 5A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與UM-UC-3-EXOvector組和PBS組相比，UM-UC-3-EXOLNMAT2促進(jìn)了腫瘤的生長（Figure 5，B-D），體現(xiàn)在腫瘤的大小、重量及增殖marker Ki67的檢測上（Figure 5，E-H）。上述數(shù)據(jù)揭示了BCa細(xì)胞分泌的外泌體LNMAT2能在體內(nèi)促進(jìn)淋巴管生成和LN轉(zhuǎn)移。
Figure 5 外泌體LNMAT2能在體內(nèi)促進(jìn)BCa淋巴管生成
5.LNMAT2與hnRNPA2B1直接相互作用
作者用RNA pull-down實(shí)驗(yàn)獲得了一個(gè)明顯的35-40kDa條帶（Figure 6A），經(jīng)質(zhì)譜（MS）證實(shí)是hnRNPA2B1（Figure 6B），通過WB檢測也說明了LNMAT2特異地與hnRNPA2B1結(jié)合（Figure 6，C和D）。此外，LNMAT2FISH和hnRNPA2B1免疫染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了LNMAT2和hnRNPA2B1主要集中在BCa細(xì)胞的胞質(zhì)中（Figure 6E）。RNA免疫沉淀（RIP）結(jié)果驗(yàn)證了LNMAT2和hnRNPA2B1之間的相互作用（Figure 6F）。隨后通過序列分析進(jìn)一步尋找到LNMAT2和hnRNPA2B1相互作用的區(qū)域（Figure 6K）。
Figure 6 LNMAT2與hnRNPA2B1直接相互作用
6.hnRNPA2B1介導(dǎo)LNMAT2包裝進(jìn)外泌體
作者想驗(yàn)證LNMAT2與hnRNPA2B1之間的相互作用是否能促進(jìn)LNMAT2包裝進(jìn)外泌體，于是，作者將hnRNPA2B1敲低，發(fā)現(xiàn)BCa細(xì)胞分泌的外泌體LNMAT2水平降低，而BCa細(xì)胞中LNMAT2水平?jīng)]有變化。隨后，通過突變LNMAT2與hnRNPA2B1之間的結(jié)合位點(diǎn)，證明了hnRNPA2B1與這些結(jié)合位點(diǎn)之間的相互作用對于LNMAT2包裝成外泌體很重要（Figure 7B）。此外，與miR-18a相比，這是一種只在細(xì)胞中存在，而外泌體中沒有的miRNA，LNMAT2呈現(xiàn)了較高的外泌體-細(xì)胞的比率（Figure 7C）。hnRNPA2B1敲低后顯著降低了BCa細(xì)胞分泌的外泌體中LNMAT2和miR-98富集水平（Figure 7D），這表明了LNMAT2以hnRNPA2B1依賴的方式特異性地包裝進(jìn)外泌體。
7.外泌體LNMAT2能被HLECs吸收并誘導(dǎo)其淋巴管生成
作者將純化的外泌體進(jìn)行PKH67綠色熒光標(biāo)記，并與HLECs孵育12h。共聚焦圖片顯示受體細(xì)胞HLECs胞質(zhì)中有綠色熒光信號，而對照組中沒有觀察到PKH67熒光信號（Figure 7E）。此外，作者發(fā)現(xiàn)HLECs與外泌體共孵育后，其LNMAT2表達(dá)顯著提高（Figure 7F）。
作者用CRISPR/Cas9方法敲除了HLECs中LNMAT2，建立了LNMAT2-KO細(xì)胞系，再進(jìn)行LNMAT2缺失檢測，表明內(nèi)源性LNMAT2表達(dá)成功被抑制（Figure 7H）。隨后再考察外泌體LNMAT2對LNMAT2-WT和LNMAT2-KO細(xì)胞的影響，通過成管和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染了干擾對照組（si-NC）5637細(xì)胞分泌的外泌體(5637-EXOsi-NC)相比，轉(zhuǎn)染了si-LNMAT2#1的5637細(xì)胞分泌的外泌體能降低LNMAT2-KO HLEC的增殖和遷移（Figure 7，I-K）。上述這些結(jié)果表明，BCa細(xì)胞通過向HLECs傳遞外泌體LNMAT2來誘導(dǎo)淋巴管生成。
Figure 7LNMAT2以hnRNPA2B1依賴的方式包裝入外泌體中并傳遞到HLECs
8.外泌體LNMAT2獨(dú)立于VEGF-C上調(diào)PROX1表達(dá)
之前的文獻(xiàn)報(bào)道了腫瘤細(xì)胞和TAMs產(chǎn)生的VEGF-C有助于BCa中淋巴管生成和LN轉(zhuǎn)移，然而，20%以上伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的BCa呈低VEGF-C表達(dá)。作者的研究結(jié)果顯示，無論是LNMAT2過表達(dá)還是LNMAT2敲低，5637和UM-UC-3細(xì)胞中VEGF-C的mRNA或蛋白水平基本都沒有改變，這也說明了BCa中LNMAT2誘導(dǎo)的淋巴管生成和LN轉(zhuǎn)移可能通過一種獨(dú)立于VEGF-C的機(jī)制而發(fā)生的。
有研究報(bào)道，PROX1通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)移，對淋巴管系統(tǒng)的發(fā)育比較重要。有趣的是，與對照組相比，用外泌體LNMAT2處理HLECs，其PROX1表達(dá)顯著提高（Figure 8，A和B），表明在HLECs中外泌體LNMAT2能上調(diào)PROX1表達(dá)。
9.外泌體LNMAT2能與PROX1啟動子形成DNA-RNA三聚體
作者研究發(fā)現(xiàn)，外泌體LNMAT2大量富集到HLECs的細(xì)胞核中，隨后通過螢光素酶和CHIRP實(shí)驗(yàn)證明了外泌體LNMAT2與HLECs中PROX1啟動子的P3（-607bp至-597bp）區(qū)域相互作用（Figure 8，C-F）。
為了進(jìn)一步研究LNMAT2是否直接與PROX1啟動子相互作用，作者使用LongTarget工具獲得了5對潛在的三聚體形式的寡核苷酸（TFOs）和它們對應(yīng)的三聚體目標(biāo)位點(diǎn)（TTSs），并且每個(gè)結(jié)合位置可以用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）分析和圓二色性（CD）光譜檢測。經(jīng)過多個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，說明了外泌體LNMAT可通過與hnRNPA2B1直接作用以增強(qiáng)PROX1啟動子的H3K4me3水平，從而上調(diào)PROX1表達(dá)（Figure 8）。
Figure 8外泌體LNMAT2與PROX1啟動子形成一種DNA-RNA三聚體
10.外泌體LNMAT2與hnRNPA2B1相互作用，以促進(jìn)PROX1啟動子處的H3K4三甲基化
作者探討了HLECs中hnRNPA2B1是否通過調(diào)節(jié)PROX1啟動子區(qū)域的H3K4me3水平而參與外泌體LNMAT2誘導(dǎo)的PROX1轉(zhuǎn)錄激活。用5637-EXOLNMAT2、UM-UC-3-EXOLNMAT2和5637-EXOsi-LNMAT2#1分別處理HLECs，結(jié)合CHIP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)外泌體LNMAT能與hnRNPA2B1直接相互作用并增加PROX1啟動子區(qū)H3K4me3水平，從而上調(diào)PROX1表達(dá)水平。
11.外泌體LNMAT2誘導(dǎo)引起PROX1上調(diào)促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移
接下來，作者減少外泌體中LNMAT2表達(dá)，會使腫瘤誘導(dǎo)的HLEC增殖、遷移功能隨之降低（Figure 9，A-C）。而干擾PROX1會顯著消除外泌體LNMAT2引起的HLEC成管和遷移現(xiàn)象，并且是獨(dú)立于VEGF-C的方式，因此，PROX1對于體外外泌體LNMAT2介導(dǎo)的獨(dú)立于VEGF-C而引起淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是必需的。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過VEGF-C中和抗體處理后，與UM-UC-3-EXOvector組相比，UM-UC-3-EXOLNMAT2組腘窩LNs體積更大（Figure 9，D-F）。小鼠BCa組織的IHC結(jié)果也說明了LNMAT2高水平時(shí)，腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍區(qū)域的LYVE-1陽性淋巴管中PROX1表達(dá)均升高（Figure 9，G-I）。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明，外泌體LNMAT2上調(diào)PROX1表達(dá)，以VEGF-C無關(guān)的方式誘導(dǎo)BCa淋巴轉(zhuǎn)移。
Figure 9PROX1是外泌體LNMAT2介導(dǎo)的淋巴管生成所必需的
12.外泌體LNMAT2與BCa患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)
作者發(fā)現(xiàn)在另外206例患者的檢測中，LNMAT2過表達(dá)與BCa組織瘤內(nèi)和瘤周圍區(qū)域淋巴管密度增加有關(guān)（Figure 10，A和B）。ISH結(jié)果顯示，當(dāng)BCa患者中外泌體LNMAT2高表達(dá)時(shí)，腫瘤組織中LNMAT2水平也會顯著升高，這表明外泌體LNMAT2在與LNMAT2相關(guān)的BCa淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起重要作用。隨后，作者考察外泌體LNMAT2是否與BCa淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的BCa患者的外泌體LNMAT2表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的BCa患者（Figure 10C）。此外，Kaplan-Meier分析顯示外泌體LNMAT2表達(dá)水平高與BCa的不良預(yù)后有關(guān)（Figure 10，D和E）。受試者工作特征曲線（ROC）分析顯示，尿液中的外泌體LNMAT2可區(qū)分BCa患者于健康對照組，且AUC曲線對于BCa淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確性判斷更高（Figure 10，F(xiàn)和G）。同時(shí)，作者也檢測了血清中外泌體LNMAT2水平，也發(fā)現(xiàn)LN轉(zhuǎn)移的BCa患者血清中外泌體LNMAT2表達(dá)顯著提高。綜上所述，作者的結(jié)果表明，外泌體LNMAT2可能是BCa患者LN轉(zhuǎn)移的一個(gè)潛在診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)（Figure 10H）。
Figure 10外泌體LNMAT2與BCa患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)
九游會j9生物一直致力為外泌體研究提供整體解決方案，從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、外泌體分離、外泌體鑒定、外泌體分子檢測到外泌體示蹤和體內(nèi)外功能驗(yàn)證，豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)、專業(yè)的科研團(tuán)隊(duì)、優(yōu)質(zhì)的技術(shù)支持服務(wù)，為您的項(xiàng)目保駕護(hù)航！
結(jié)論：
在本篇文章，作者發(fā)現(xiàn)了BCa中外泌體lncRNA介導(dǎo)了一個(gè)與VEF-C無關(guān)的LN轉(zhuǎn)移機(jī)制，并且鑒定LNMAT2可以作為BCa淋巴轉(zhuǎn)移的一個(gè)治療靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)：
J Clin Invest.2020 Jan 2;130(1):404-421. Exosomal long noncoding RNA LNMAT2 promotes lymphatic metastasis in bladder cancer.
