時(shí)間：2017-08-17 熱度：

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma multiforme）是腦癌中死亡率最高和最常見(jiàn)的一種，是除腦干膠質(zhì)瘤外預(yù)后情況最不樂(lè)觀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥。

雪上加霜的是，目前的所有治療手段都無(wú)法治愈膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，患者的中位生存期僅有12.2-18.2個(gè)月。因此，全世界的科學(xué)家、醫(yī)生都在努力檢測(cè)和治療這種惡性疾病。
在基因檢測(cè)層面，人們對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者進(jìn)行的基因圖譜分析發(fā)現(xiàn)了223個(gè)基因中的453個(gè)突變位點(diǎn)，并最終找出71個(gè)顯著突變基因（SMGs）。然而，大量新發(fā)現(xiàn)的基因功能從未被解讀，特別是這些基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的作用尚不清楚。

而由于不同患者個(gè)體中的基因突變組合不同，九游會(huì)j9難以解釋復(fù)雜的突變與疾病的因果關(guān)系，也造成膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者病程的差異化及抗藥性的不同。
因此，九游會(huì)j9需要對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行深入的基因功能分析和表型定量測(cè)定，這對(duì)于治療該疾病至關(guān)重要。但是，目前沒(méi)有任何一項(xiàng)研究能夠給出結(jié)論，說(shuō)明在患者中發(fā)現(xiàn)的某些突變基因能夠驅(qū)動(dòng)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

本周一，來(lái)自耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的華人科學(xué)家Sidi Chen與瑞士巴塞爾的Randall J Platt教授，以及CRISPR領(lǐng)域大牛張鋒教授合作，在Nature Neuroscience發(fā)表了最新工作[1]。他們借助AAV病毒載體介導(dǎo)的在體CRISPR掃描技術(shù)，在完全免疫活性的小鼠腦中，利用獲取測(cè)序手段讀取突變數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組分析等多技術(shù)，成功地篩選了一系列導(dǎo)致腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生的關(guān)鍵基因突變。

九游會(huì)j9生物 一直關(guān)注腫瘤研究領(lǐng)域的重大研究進(jìn)展，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的病毒工具和整體解決方案，助力臨床轉(zhuǎn)化和基因治療！
實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論：

1. 腦定位注射AAV-CRISPR庫(kù)誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的產(chǎn)生

為了在小鼠腦中直接檢測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相關(guān)的顯著突變基因功能，作者開(kāi)發(fā)了一套基于AAV載體和CRISPR技術(shù)的在體掃描策略，直接在小鼠腦原位構(gòu)建膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型（圖1）。

圖1 AAV-CRISPR篩選策略

通過(guò)將抑癌基因（mTSG）庫(kù)（該庫(kù)包含針對(duì)Trp53的sgRNA，用于促進(jìn)小鼠組織的腫瘤發(fā)生，亦包含其他的顯著突變基因靶點(diǎn)sgRNA）注射到腦中，配合MRI掃描，作者發(fā)現(xiàn)注射mTSG庫(kù)的動(dòng)物明顯出現(xiàn)了腫瘤，且動(dòng)物的生存周期亦明顯降低（圖2）。這說(shuō)明AAV-CRISPR策略能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤的產(chǎn)生。

圖2 注射mTSG突變庫(kù)的小鼠腦中 明顯出現(xiàn)了腫瘤 2. AAV-mTSG注射的小鼠腦腫瘤展現(xiàn)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的特點(diǎn)

通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)AAV-mTSG注射的小鼠所產(chǎn)生的腫瘤非常明顯，其特征與人類(lèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的腫瘤特征非常像，提示AAV-mTSG成功誘導(dǎo)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型（圖3）。

圖3 AAV-mTSG注射的小鼠腦腫瘤展現(xiàn)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的特征 3. 靶向測(cè)序手段篩選到多個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤突變基因

構(gòu)建模型的目的在于找到腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，為了達(dá)到此目的，作者應(yīng)用靶向獲取測(cè)序（Targeted-capture sequencing）的手段，在AAV-mTSG鼠的腦中篩選到了若干突變基因（圖4）。

圖4 利用對(duì)sgRNA的靶向測(cè)序手段篩選到的若干膠質(zhì)母細(xì)胞瘤關(guān)鍵基因突變

通過(guò)癌癥圖譜分析，以及與耶魯大學(xué)膠質(zhì)瘤細(xì)胞庫(kù)的比對(duì)，作者分析了突變基因的功能，作者證實(shí)AAV-CRISPR系統(tǒng)構(gòu)建的原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型能夠定量發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的腫瘤抑癌基因靶點(diǎn)（圖5）。

圖5 癌癥圖譜分析腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵突變基因 4. 并發(fā)突變分析（Co-mutation）發(fā)現(xiàn)高頻并發(fā)基因

通過(guò)并發(fā)突變分析，作者從總計(jì)1540對(duì)潛在突變基因中篩選到76對(duì)具顯著意義的突變基因，且這些基因也同時(shí)在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者腦中發(fā)生共同突變（圖6），例如RB1和TP53, PTEN和RB1, RASA1和STK11等共同突變。

圖6 并發(fā)突變分析找到同時(shí)突變的關(guān)鍵基因 5. sgRNA Minipool技術(shù)驗(yàn)證突變靶點(diǎn)

接下來(lái)，作者利用sgRNA迷你突變庫(kù)檢測(cè)前文發(fā)現(xiàn)的高代表性突變基因或共同突變基因的功能，策略如圖7a，發(fā)現(xiàn)多個(gè)或多對(duì)突變基因確實(shí)能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的產(chǎn)生（圖7）。

圖7 sgRNA Minipool技術(shù)驗(yàn)證突變靶點(diǎn)的致癌 6. 轉(zhuǎn)錄組分析膠質(zhì)母細(xì)胞瘤不同突變細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特性

通過(guò)對(duì)不同突變基因?qū)е碌哪z質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行mRNA測(cè)序，作者鑒定了不同突變細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特性（圖8）。例如，通過(guò)比較Rb1和Nf1突變細(xì)胞，作者發(fā)現(xiàn)了616個(gè)和982個(gè)在Rb1細(xì)胞和Nf1細(xì)胞高表達(dá)的基因（圖8b）。通過(guò)大量的分析，包括共同突變，他們發(fā)現(xiàn)Mll3突變會(huì)明顯影響Nf1突變細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)，而Zc3h13基因突變則會(huì)明顯影響Rb1突變細(xì)胞的表達(dá)。

圖8 轉(zhuǎn)錄組分析不同突變細(xì)胞的基因表達(dá)情況 7. 轉(zhuǎn)錄組分析與化學(xué)療法耐藥性

文末，作者設(shè)計(jì)了藥物治療的RNA測(cè)序?qū)嶒?yàn)（圖9），結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rb1突變的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Zc3h13或Pten基因突變會(huì)增加TMZ化療藥物的耐藥性，這提示未來(lái)的癌癥需要考慮不同突變基因的耐藥性問(wèn)題。

圖9 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)耐藥基因突變 總結(jié)：

利用AAV病毒載體，搭載CRISPR基因編輯技術(shù)，作者構(gòu)建了一套極具特色的體內(nèi)抑癌基因篩選策略，為未來(lái)癌癥突變基因的篩選提供了新的辦法。九游會(huì)j9恭喜Chen教授的優(yōu)秀工作順利發(fā)表，希望未來(lái)有更多的重磅發(fā)現(xiàn)能夠幫助人類(lèi)對(duì)抗癌癥。

參考文獻(xiàn)：
[1] Chow RD, Guzman CD, Wang G, Schmidt F, Youngblood MW, Ye L, et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature neuroscience. 2017.