腫瘤微環(huán)境研究綜述
2023年1月30日，荷蘭癌癥研究院在Nat Rev Cancer上發(fā)表了一篇“Mechanisms driving the immunoregulatory function of cancer cells”的文章。癌癥細胞的內(nèi)在特征通常是由遺傳和表觀遺傳變異、信號傳導(dǎo)失控或代謝改變驅(qū)動的，為癌癥細胞提供了生長和生存優(yōu)勢。癌細胞固有程序還通過分泌組、細胞與細胞的直接接觸、細胞外囊泡的形成和運輸或營養(yǎng)物質(zhì)的可用性影響與免疫系統(tǒng)的通信。作者討論了癌細胞內(nèi)在機制如何協(xié)調(diào)腫瘤免疫微環(huán)境，以及這些機制如何導(dǎo)致腫瘤之間免疫環(huán)境的多樣性、影響免疫逃避以及影響對癌癥免疫治療的反應(yīng)。
此外，2024年2月在Nat Rev Cancer雜志上也發(fā)表了一篇關(guān)于腫瘤微環(huán)境非遺傳因素驅(qū)動癌癥的綜述（Beyond genetics: driving cancer with the tumour microenvironment behind the wheel）。首先對腫瘤微環(huán)境（TME）中驅(qū)動惡性腫瘤的細胞外因素進行了介紹，包括：轉(zhuǎn)化細胞與周圍健康組織間的競爭、炎癥對腫瘤發(fā)生的促進作用、間質(zhì)成纖維細胞對癌癥的驅(qū)動、微環(huán)境中的機械力以及血管淋巴管和神經(jīng)新生對癌癥的影響。第二部分介紹了細胞固有的非遺傳因素對癌癥的驅(qū)動作用，包括TME誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子失調(diào)、染色質(zhì)動力學(xué)的影響及癌癥進展的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。文章全面的總結(jié)了驅(qū)動腫瘤的非遺傳因素，提出癌變和腫瘤進展的過程可以看作是遺傳和非遺傳因素之間的動態(tài)平衡，這種平衡是為適應(yīng)癌細胞起源及腫瘤進展過程中不斷變化的微環(huán)境而量身定制的。
空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)
腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性是阻礙抗癌治療成功的核心問題之一。了解TME組裝的空間結(jié)構(gòu)對于發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生機制和設(shè)計新的治療策略至關(guān)重要?？臻g轉(zhuǎn)錄組(spatial transcription)的出現(xiàn)為高通量測序加上了空間的坐標(biāo)信息，為神經(jīng)科學(xué)、發(fā)育學(xué)、植物學(xué)、病理學(xué)等領(lǐng)域提供了強有力的研究手段。
空間轉(zhuǎn)錄組主要有兩種策略：
（1）基于NGS的策略，這一策略的核心思想是給不同位置來源的reads帶上具有空間信息的短序列(空間barcode/ID)（代表性技術(shù)如10x Visium、10x CytAssist、10x Xenium、10x Visium HD、華大Stereo-seq等）；
（2）基于圖像(Image)的策略，這一策略主要為原位擴增+原位測序、原位雜交（代表性技術(shù)如SeqFISH、MERFISH等）。
無論是那種策略，最終目的都是得到帶有坐標(biāo)信息的基因矩陣，再加上分組中設(shè)置的時間關(guān)系，甚至可以得到時空轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。
1、基于NGS策略的空間組學(xué)技術(shù)
基于NGS策略的空間組學(xué)技術(shù)可進一步分為固相轉(zhuǎn)錄組捕獲（Solid-phase transcriptome capture）技術(shù)和確定性空間條形碼（Deterministic spatial barcoding ）技術(shù),其中前者捕獲范圍大，獲取的信息更多。隨著技術(shù)更迭，空間分辨率在逐步提升。
下面介紹幾個代表性的固相轉(zhuǎn)錄組捕獲技術(shù)：
1）10x Visium
作為當(dāng)前廣泛應(yīng)用的Visium技術(shù)的前身，其核心原理是將空間條形碼寡核苷酸引物固定在載玻片上，然后將組織貼于載玻片實現(xiàn)組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄組序列的捕獲與檢測。每個Visium捕獲區(qū)域面積為6.5mm×6.5mm，包含約5000個直徑為55μm的Spots（spot圓心之間的距離為100μm）。
2）10x CytAssist
基于CytAssist儀器進行檢測，可根據(jù)組織大小進行靈活選用（6.5mm×6.5mm 或11mm×11mm）。Visium平臺還支持FFPE樣本的檢測，極大提升了Visium技術(shù)的可及性。
3）10x Visium HD
采用2 μm的方形連續(xù)網(wǎng)格圖案，彼此之間沒有間隙，大大提升了信號密度，可以實現(xiàn)單細胞的分辨率。Visium HD包含了6.5 x 6.5 mm捕獲區(qū)域，以2 x 2 µm為檢測單元，實現(xiàn)單細胞級的空間分辨率。推薦以8 x 8 µm作為可視化和分析單元。
4）華大Stereo-seq
在DNA納米球（DNBs）上進行原位RNA捕獲，通過滾環(huán)擴增（RCA）產(chǎn)生隨機條形碼序列并加載到芯片表面，Spot大小約為220nm，可產(chǎn)生亞細胞級轉(zhuǎn)錄圖譜。
各個平臺技術(shù)參數(shù)比較如下：
2、空間組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析內(nèi)容
有很多能夠分析空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)的工具包，例如Giotto、Seurat、STUtility、STLearn等。在測序質(zhì)量方面，除了做定量時可以觀察信噪比，對于不同spots捕獲到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量也可以一定程度上反應(yīng)測序質(zhì)量與批次效應(yīng)。而在許多空間轉(zhuǎn)錄組可以達到亞細胞分辨率的現(xiàn)在，如何將spots劃分到不同的細胞中也成為了一種“幸福的煩惱”。
下面進行詳細介紹：
1）Spot cluster聚類
單細胞中的降維方法如PCA、tSNE、UMAP等依舊可以用于spots聚類。還有一些更復(fù)雜的矩陣分析方法，例如共表達？櫸治?、非负矩阵芳?、因子分析等依然可以用于識別特定的細胞cluster。但在空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)中，除了考慮細胞/spots之間的表達相似程度外，還需要考慮在空間中是否相鄰或連續(xù)。
2）Select ？櫸治
像單細胞中提取特定亞群進行分析，空間轉(zhuǎn)錄組也可以選取特定的？榻蟹治觶綞裥宰櫓謀咴稻褪且桓齪苤檔霉刈⒌那。當(dāng)然，選擇特定的基因觀察其是否具有特定的空間分布也是一種思路，如利用BinSpect進行臨近富集分析、利用Haystack進行熵值計算、利用SpatialDE或SPARK進行高斯回歸計算都是不錯的嘗試。
3）基因集評分分析（Score）
針對對一些特定基因集進行生物學(xué)意義的探尋，很多基因集評分方法（如AddModuleScore、ssGSEA、GSVA、AUCell等）都可以用。
4）細胞類型鑒定（Characterize）
對細胞類型的鑒別一直是一個難題，除了單純看marker基因表達外，富集分析(如GSEA、KEGG、GO等)也是很好的方法。此外，對spot所屬細胞類型的鑒定也有很多策略，通過使用scRNA-seq 數(shù)據(jù)的細胞類型特異性基因表達信息對空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進行反卷積（如MuSiC、RCTD、SPOTlight、Cell2location、SpatialDWLS、Stereoscope、CARD等），推斷每個空間位置的細胞類型組成。
5）其他分析
在單細胞中常用到的分析如擬時序分析、細胞通訊分析等也都可以在空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中進行計算。
6）聯(lián)合分析
一些組織病理學(xué)相關(guān)的機器學(xué)習(xí)方法可以與空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析，或是一些DNA seqFISH、RNA seqFISH等雜交技術(shù)亦可以與空間轉(zhuǎn)錄組相互佐證。多重免疫熒光（Multiplexed Immunofluorescence）, 超多蛋白檢測平臺 (CODEX，CO-Detection by IndEXing)、t-cyCIF等空間蛋白高通量檢測技術(shù)與空間轉(zhuǎn)錄組也能形成很好的互補。
3、樣本收集
1）OCT包埋冰凍組織/白片/切片
制備 OCT包埋冰凍組織塊，建議組織大小為長×寬不超過 6.5mm×6.5mm，高度≥5mm；白片或貼片建議準(zhǔn)備6-13 片（10μm 厚度）。封裝好用干冰進行寄送。
2）FFPE包埋組織/白片/切片
石蠟包埋組織封裝好后，4℃進行寄送。
石蠟包埋白片或貼片建議準(zhǔn)備6-13 片（5μm 厚度），4℃進行寄送。
參考文獻
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