腫瘤微環(huán)境研究綜述
2023年1月30日，荷蘭癌癥研究院在Nat Rev Cancer上發(fā)表了一篇“Mechanisms driving the immunoregulatory function of cancer cells”的文章。癌癥細(xì)胞的內(nèi)在特征通常是由遺傳和表觀遺傳變異、信號(hào)傳導(dǎo)失控或代謝改變驅(qū)動(dòng)的，為癌癥細(xì)胞提供了生長(zhǎng)和生存優(yōu)勢(shì)。癌細(xì)胞固有程序還通過(guò)分泌組、細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸、細(xì)胞外囊泡的形成和運(yùn)輸或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可用性影響與免疫系統(tǒng)的通信。作者討論了癌細(xì)胞內(nèi)在機(jī)制如何協(xié)調(diào)腫瘤免疫微環(huán)境，以及這些機(jī)制如何導(dǎo)致腫瘤之間免疫環(huán)境的多樣性、影響免疫逃避以及影響對(duì)癌癥免疫治療的反應(yīng)。
此外，2024年2月在Nat Rev Cancer雜志上也發(fā)表了一篇關(guān)于腫瘤微環(huán)境非遺傳因素驅(qū)動(dòng)癌癥的綜述（Beyond genetics: driving cancer with the tumour microenvironment behind the wheel）。首先對(duì)腫瘤微環(huán)境（TME）中驅(qū)動(dòng)惡性腫瘤的細(xì)胞外因素進(jìn)行了介紹，包括：轉(zhuǎn)化細(xì)胞與周圍健康組織間的競(jìng)爭(zhēng)、炎癥對(duì)腫瘤發(fā)生的促進(jìn)作用、間質(zhì)成纖維細(xì)胞對(duì)癌癥的驅(qū)動(dòng)、微環(huán)境中的機(jī)械力以及血管淋巴管和神經(jīng)新生對(duì)癌癥的影響。第二部分介紹了細(xì)胞固有的非遺傳因素對(duì)癌癥的驅(qū)動(dòng)作用，包括TME誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子失調(diào)、染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)的影響及癌癥進(jìn)展的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。文章全面的總結(jié)了驅(qū)動(dòng)腫瘤的非遺傳因素，提出癌變和腫瘤進(jìn)展的過(guò)程可以看作是遺傳和非遺傳因素之間的動(dòng)態(tài)平衡，這種平衡是為適應(yīng)癌細(xì)胞起源及腫瘤進(jìn)展過(guò)程中不斷變化的微環(huán)境而量身定制的。
空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)
腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性是阻礙抗癌治療成功的核心問(wèn)題之一。了解TME組裝的空間結(jié)構(gòu)對(duì)于發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生機(jī)制和設(shè)計(jì)新的治療策略至關(guān)重要。空間轉(zhuǎn)錄組(spatial transcription)的出現(xiàn)為高通量測(cè)序加上了空間的坐標(biāo)信息，為神經(jīng)科學(xué)、發(fā)育學(xué)、植物學(xué)、病理學(xué)等領(lǐng)域提供了強(qiáng)有力的研究手段。
空間轉(zhuǎn)錄組主要有兩種策略：
（1）基于NGS的策略，這一策略的核心思想是給不同位置來(lái)源的reads帶上具有空間信息的短序列(空間barcode/ID)（代表性技術(shù)如10x Visium、10x CytAssist、10x Xenium、10x Visium HD、華大Stereo-seq等）；
（2）基于圖像(Image)的策略，這一策略主要為原位擴(kuò)增+原位測(cè)序、原位雜交（代表性技術(shù)如SeqFISH、MERFISH等）。
無(wú)論是那種策略，最終目的都是得到帶有坐標(biāo)信息的基因矩陣，再加上分組中設(shè)置的時(shí)間關(guān)系，甚至可以得到時(shí)空轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。
1.基于NGS策略的空間組學(xué)技術(shù)
基于NGS策略的空間組學(xué)技術(shù)可進(jìn)一步分為固相轉(zhuǎn)錄組捕獲（Solid-phase transcriptome capture）技術(shù)和確定性空間條形碼（Deterministic spatial barcoding ）技術(shù),其中前者捕獲范圍大，獲取的信息更多。隨著技術(shù)更迭，空間分辨率在逐步提升。
下面介紹幾個(gè)代表性的固相轉(zhuǎn)錄組捕獲技術(shù)：
1）10x Visium
作為當(dāng)前廣泛應(yīng)用的Visium技術(shù)的前身，其核心原理是將空間條形碼寡核苷酸引物固定在載玻片上，然后將組織貼于載玻片實(shí)現(xiàn)組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄組序列的捕獲與檢測(cè)。每個(gè)Visium捕獲區(qū)域面積為6.5mm×6.5mm，包含約5000個(gè)直徑為55μm的Spots（spot圓心之間的距離為100μm）。
2）10x CytAssist
基于CytAssist儀器進(jìn)行檢測(cè)，可根據(jù)組織大小進(jìn)行靈活選用（6.5mm×6.5mm 或11mm×11mm）。Visium平臺(tái)還支持FFPE樣本的檢測(cè)，極大提升了Visium技術(shù)的可及性。
3）10x Visium HD
采用2 μm的方形連續(xù)網(wǎng)格圖案，彼此之間沒(méi)有間隙，大大提升了信號(hào)密度，可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的分辨率。Visium HD包含了6.5 x 6.5 mm捕獲區(qū)域，以2 x 2 µm為檢測(cè)單元，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞級(jí)的空間分辨率。推薦以8 x 8 µm作為可視化和分析單元。
4）華大Stereo-seq
在DNA納米球（DNBs）上進(jìn)行原位RNA捕獲，通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）產(chǎn)生隨機(jī)條形碼序列并加載到芯片表面，Spot大小約為220nm，可產(chǎn)生亞細(xì)胞級(jí)轉(zhuǎn)錄圖譜。
各個(gè)平臺(tái)技術(shù)參數(shù)比較如下：
2.空間組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析內(nèi)容
有很多能夠分析空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)的工具包，例如Giotto、Seurat、STUtility、STLearn等。在測(cè)序質(zhì)量方面，除了做定量時(shí)可以觀察信噪比，對(duì)于不同spots捕獲到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量也可以一定程度上反應(yīng)測(cè)序質(zhì)量與批次效應(yīng)。而在許多空間轉(zhuǎn)錄組可以達(dá)到亞細(xì)胞分辨率的現(xiàn)在，如何將spots劃分到不同的細(xì)胞中也成為了一種“幸福的煩惱”。
下面進(jìn)行詳細(xì)介紹：
1）Spot cluster聚類
單細(xì)胞中的降維方法如PCA、tSNE、UMAP等依舊可以用于spots聚類。還有一些更復(fù)雜的矩陣分析方法，例如共表達(dá)模塊分析、非負(fù)矩陣分解、因子分析等依然可以用于識(shí)別特定的細(xì)胞cluster。但在空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)中，除了考慮細(xì)胞/spots之間的表達(dá)相似程度外，還需要考慮在空間中是否相鄰或連續(xù)。
2）Select ？櫸治
像單細(xì)胞中提取特定亞群進(jìn)行分析，空間轉(zhuǎn)錄組也可以選取特定的？榻蟹治，如惡性組織的邊緣就是一個(gè)很值得關(guān)注的區(qū)域。當(dāng)然，選擇特定的基因觀察其是否具有特定的空間分布也是一種思路，如利用BinSpect進(jìn)行臨近富集分析、利用Haystack進(jìn)行熵值計(jì)算、利用SpatialDE或SPARK進(jìn)行高斯回歸計(jì)算都是不錯(cuò)的嘗試。
3）基因集評(píng)分分析（Score）
針對(duì)對(duì)一些特定基因集進(jìn)行生物學(xué)意義的探尋，很多基因集評(píng)分方法（如AddModuleScore、ssGSEA、GSVA、AUCell等）都可以用。
4）細(xì)胞類型鑒定（Characterize）
對(duì)細(xì)胞類型的鑒別一直是一個(gè)難題，除了單純看marker基因表達(dá)外，富集分析(如GSEA、KEGG、GO等)也是很好的方法。此外，對(duì)spot所屬細(xì)胞類型的鑒定也有很多策略，通過(guò)使用scRNA-seq 數(shù)據(jù)的細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)信息對(duì)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行反卷積（如MuSiC、RCTD、SPOTlight、Cell2location、SpatialDWLS、Stereoscope、CARD等），推斷每個(gè)空間位置的細(xì)胞類型組成。
5）其他分析
在單細(xì)胞中常用到的分析如擬時(shí)序分析、細(xì)胞通訊分析等也都可以在空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中進(jìn)行計(jì)算。
6）聯(lián)合分析
一些組織病理學(xué)相關(guān)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法可以與空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析，或是一些DNA seqFISH、RNA seqFISH等雜交技術(shù)亦可以與空間轉(zhuǎn)錄組相互佐證。多重免疫熒光（Multiplexed Immunofluorescence）, 超多蛋白檢測(cè)平臺(tái) (CODEX，CO-Detection by IndEXing)、t-cyCIF等空間蛋白高通量檢測(cè)技術(shù)與空間轉(zhuǎn)錄組也能形成很好的互補(bǔ)。
3.樣本收集
1）OCT包埋冰凍組織/白片/切片
制備 OCT包埋冰凍組織塊，建議組織大小為長(zhǎng)×寬不超過(guò) 6.5mm×6.5mm，高度≥5mm；白片或貼片建議準(zhǔn)備6-13 片（10μm 厚度）。封裝好用干冰進(jìn)行寄送。
2）FFPE包埋組織/白片/切片
石蠟包埋組織封裝好后，4℃進(jìn)行寄送。
石蠟包埋白片或貼片建議準(zhǔn)備6-13 片（5μm 厚度），4℃進(jìn)行寄送。
參考文獻(xiàn)
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