研究背景
肝臟是最具再生能力的實(shí)體器官，在維持哺乳動(dòng)物生理穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著多種重要功能。肝臟由重復(fù)的結(jié)構(gòu)和功能單位組成，稱為肝小葉。根據(jù)功能梯度，肝小葉大致分為兩個(gè)主要的互補(bǔ)區(qū)域：門靜脈周圍區(qū)(PP)和中心周圍區(qū)(PC)；肝臟損傷最常發(fā)生在PP區(qū)或PC區(qū)。研究團(tuán)隊(duì)利用譜系示蹤、單細(xì)胞測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組、免疫染色鑒定及體內(nèi)功能評(píng)估等多模態(tài)技術(shù)，解析了四氯化碳誘導(dǎo)的急性PC區(qū)肝損傷后再生規(guī)律。
研究材料
1、對(duì)Cyp2e1-DreER;H11-tdTomato小鼠進(jìn)行CCl4誘導(dǎo)處理，處理0,2,4,7,14天后分離出RFP+ PC hepatocytes進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序；
2、對(duì)wild-type小鼠進(jìn)行CCl4誘導(dǎo)處理，處理0,2,3,4天后的肝臟組織進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組。
研究結(jié)果
一.急性PC損傷后肝細(xì)胞的形態(tài)追蹤
CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷動(dòng)物模型是最常見(jiàn)方法之一。CCl4注射2 天后，CYP2E1+GS+ PC肝細(xì)胞完全消失，CYP2E1+GS-PC肝細(xì)胞處于壞死區(qū)邊緣；而E-CAD+CYP2E1- PP 區(qū)沒(méi)有明顯變化（圖1A）。CCl4注射4 天后，CYP2E1+GS+ PC 肝細(xì)胞再次出現(xiàn)；7 天后，組織學(xué)損傷幾乎消失，功能恢復(fù)到接近正常狀態(tài)（圖1A和1B）。該研究開(kāi)發(fā)了一個(gè)與PC區(qū)相關(guān)性肝病密切相關(guān)的遺傳系統(tǒng)，通過(guò)特異性標(biāo)記Cyp2e1+ PC肝細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)急性PC損傷后損傷區(qū)附近殘留肝細(xì)胞的形態(tài)追蹤。譜系示蹤結(jié)果表明：CCl4誘導(dǎo)PC肝細(xì)胞的急性丟失主要通過(guò)CYP2E1+PC 肝細(xì)胞增值進(jìn)行修復(fù)，并輔之以CYP2E1-PC 肝細(xì)胞增值。
圖1 CYP2E1+ PC 肝細(xì)胞的譜系追蹤
二.PC肝細(xì)胞再生的轉(zhuǎn)錄特征
對(duì)Cyp2e1-DreER;H11-tdTomato小鼠進(jìn)行CCl4誘導(dǎo)處理，處理0,2,4,7,14天后分離RFP+ PC hepatocytes進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。這些細(xì)胞分為14個(gè)clusters，其中cluster8和cluster14屬于CCl4誘導(dǎo)2天和4天后肝細(xì)胞。cluster8和cluster14高表達(dá)細(xì)胞周期及DNA復(fù)制的相關(guān)基因（H2afz, Lcn2, Tubb5, Mki67, Tmsb4x, Hmgb2, Ube2c, Stmn1, Hist1h2ap）。cluster9和cluster10屬于CCl4誘導(dǎo)4天后肝細(xì)胞，且高表達(dá)抗氧化相關(guān)基因（Gsta3，Gsta4，Cbr1，Gstp1，Esd）和糖異生相關(guān)基因（Fbp1，Eno1，Gapdh，Akr1a1）。細(xì)胞周期分析表明：cluster8細(xì)胞主要以S 期和G2M期為主，cluster14細(xì)胞主要以G2M期為主（圖2A-C）。
CCl4誘導(dǎo)2天和4天后，PC hepatocytes的mTOR信號(hào)通路和增值相關(guān)信號(hào)通路（G2M_checkpoint, E2F_targets, Myc_targets_v1, DNA_repair）表現(xiàn)出顯著性富集（圖2E）。Torin 1（mTOR通路）和4EGI-1抑制劑處理可顯著延遲肝修復(fù)，揭示mTOR/4E-BP1 軸有助于中心周圍再生（圖2F和G）。
圖2 RFP+ PC 肝細(xì)胞的單細(xì)胞分析
三.急性損傷后PC 肝細(xì)胞的時(shí)空表達(dá)
對(duì)wild-type小鼠CCl4處理0,2,3,4天后的肝臟組織進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組分析，將其分為4個(gè)區(qū)：zone 1、zone 2、zone 3和Dzone（圖3A和3B）。zone 1區(qū)高表達(dá)PP相關(guān)基因(Pck1, Aldh1b1, Mup20, Cyp2f2)；zone 3區(qū)高表達(dá)PC相關(guān)基因 (Gs, Oat, Cyp1a2, Cyp2a5, Cyp2e1)；zone 2區(qū)高表達(dá)PP的其他相關(guān)基因（Igfbp2, Hamp, Hamp2）（圖3C）。肝細(xì)胞基因的時(shí)空表達(dá)揭示CCl4誘導(dǎo)第2天，肝細(xì)胞表現(xiàn)出顯著性損傷；第3天，受損肝細(xì)胞開(kāi)始恢復(fù)。
對(duì)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異基因進(jìn)行表達(dá)趨勢(shì)分析，？1中基因在第2天顯著下調(diào)且隨后逐漸上調(diào)，這些基因主要參與肝功能代謝相關(guān)功能（圖3D）。？2-4中基因在第2天或第3天中顯著上調(diào)且隨后逐漸下調(diào)，這些基因主要參與細(xì)胞周期及增值（？2）、肝臟發(fā)育（？3）、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（？4）等功能（圖3D）。此外，增加乳酸脫氫酶基因Ldha的表達(dá)可以有助于PC肝細(xì)胞增值。
圖3 CCl4 誘導(dǎo)后肝損傷和肝再生的空間表達(dá)分析
四.髓系細(xì)胞亞型和纖維化反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化
在Dzone區(qū)中，髓系細(xì)胞marker基因在第2天顯著上調(diào)，第4天顯著下調(diào)（圖4A）。誘導(dǎo)處理2天后，Dzone區(qū)中單核細(xì)胞數(shù)量增多，且伴隨一小部中性粒細(xì)胞、DC、巨噬細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)；誘導(dǎo)處理3-4天后，巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而中性粒細(xì)胞和DC幾乎消失（圖4B）。HSCs相關(guān)基因（Col1a1, Col1a2, Col3a1, Sparc）在Dzone區(qū)也顯著表達(dá)，且與髓系細(xì)胞基因表達(dá)趨勢(shì)一致（圖4D）。在受損區(qū)域通過(guò)激活TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)介導(dǎo)纖維化反應(yīng)，并抑制肝細(xì)胞增殖。在肝損傷期間，髓系細(xì)胞（尤其單核細(xì)胞/MoMF）被招募到受損區(qū)域并產(chǎn)生 TGF-b1 配體激活 TGF-b1 信號(hào)傳導(dǎo)，并在肝再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
圖4 髓系細(xì)胞亞型和纖維化的動(dòng)態(tài)變化
五.RGD肽可減輕肝損傷并促進(jìn)肝再生
巨噬細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的粘附對(duì)浸潤(rùn)細(xì)胞的局部保留至關(guān)重要。ST結(jié)果表明：ECM和細(xì)胞黏連相關(guān)信號(hào)通路在Dzone區(qū)富集（圖5A和5B）。RGD肽(Arg-Gly-Asp)通過(guò)識(shí)別整合素ITGB5對(duì)ECM進(jìn)行粘附，并有助于髓系細(xì)胞（尤其單核細(xì)胞/MoMF）被招募到受損區(qū)域（圖5C和5D）。
圖5 ECM和細(xì)胞黏連相關(guān)基因的表達(dá)
小結(jié)
1）84%的新生PC區(qū)肝細(xì)胞由損傷區(qū)域周圍殘余的CYP2E1+肝細(xì)胞增殖而來(lái)，只有16%的肝細(xì)胞由先前未受損傷的PP肝細(xì)胞貢獻(xiàn)。mTOR/4EBP-1信號(hào)通路以及LDHA表達(dá)上調(diào)顯著參與了調(diào)控PC區(qū)肝細(xì)胞的再生。
2）在肝再生過(guò)程中，髓系來(lái)源的免疫細(xì)胞動(dòng)態(tài)性被招募到損傷區(qū)域，且損傷區(qū)域存在肝星狀細(xì)胞的活化以及TGF-β1信號(hào)通路的激活等系列損傷-再生反應(yīng)。
3）該研究還建立了一種基于小分子肽的減輕PC區(qū)肝損傷/促進(jìn)肝再生的有效策略。
亮點(diǎn)
采用典型的“生物模型-組學(xué)分析-定量建模-生物機(jī)制”多學(xué)科交叉研究模式，系統(tǒng)揭示了不同區(qū)域肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞協(xié)同再生的時(shí)空動(dòng)態(tài)性分子和細(xì)胞行為，為深入理解區(qū)域性肝損傷及其修復(fù)提供了全新的視野。此外，該研究建立的基于RGD肽治療損傷模型的方法，為臨床急性藥物性肝損傷提供了新的策略。
參考文獻(xiàn)
Wang S, Wang X, Shan Y, Tan Z, Su Y, Cao Y, Wang S, Dong J, Gu J, Wang Y. Region-specific cellular and molecular basis of liver regeneration after acute pericentral injury. Cell Stem Cell. 2024 Mar 7;31(3):341-358.e7. doi: 10.1016/j.stem.2024.01.013. PMID: 38402618.
