時(shí)間：2022-08-17 熱度：

前言

2022年7月，上海交通大學(xué)楊選明團(tuán)隊(duì)在Nature Communications發(fā)表“T cell receptor β-chain-targeting chimeric antigen receptor T cells against T cell malignancies”，該研究利用T細(xì)胞惡性腫瘤中T細(xì)胞受體（T cell receptor, TCR）β鏈可變區(qū)的特異性，設(shè)計(jì)和構(gòu)建嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor, CAR），通過(guò)一系列體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明這一CAR-T細(xì)胞治療策略的安全性和有效性。

 

背景介紹

T細(xì)胞惡性腫瘤盡管在化療下緩解率較高，但許多患者腫瘤仍然會(huì)復(fù)發(fā)，而T細(xì)胞惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，小分子靶向的治療方法難以開(kāi)發(fā)，因此臨床急需新的治療策略。CAR-T細(xì)胞在B細(xì)胞來(lái)源的白血病中顯示出良好的治療效果，但用它治療T細(xì)胞惡性腫瘤依然面臨諸多困難。例如CAR-T細(xì)胞的制備過(guò)程中混有腫瘤細(xì)胞，以及CAR-T細(xì)胞自相殺傷，或殺傷正常T細(xì)胞。為避免這些問(wèn)題，需要選擇腫瘤細(xì)胞特異表達(dá)的抗原。

 

在T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，TCR多樣性來(lái)源于α鏈或β鏈可變-多樣-連接區(qū)結(jié)構(gòu)域（variable-diversity-joining-domain, VDJ-domain）的基因重排。TCR β鏈可變區(qū)的編碼基因包含52個(gè)Vβ片段，1個(gè)D片段和13個(gè)J片段，同時(shí)在人體中Vβ基因片段有24個(gè)家族，每個(gè)T細(xì)胞克隆三個(gè)區(qū)各僅選擇1個(gè)片段進(jìn)行組合，因此，正常TCR庫(kù)中單個(gè)特定TCR Vβ亞型的出現(xiàn)頻率大約在0.58-10.84%。而發(fā)展為T(mén)細(xì)胞惡性腫瘤的T細(xì)胞克隆較為單一，通常只有1個(gè)特定的TCR Vβ及Vα亞型。作者利用這一特異性區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常T細(xì)胞，并應(yīng)用于CAR-T細(xì)胞設(shè)計(jì)。

 

研究思路
 

01  針對(duì)特定的Vβ亞型設(shè)計(jì)CAR-T細(xì)胞，檢測(cè)CAR-T細(xì)胞自身靶點(diǎn)表達(dá)，并通過(guò)與正常T細(xì)胞，以及Vβ8^-和Vβ8⁺配對(duì)細(xì)胞系共培養(yǎng)，檢測(cè)Vβ8-CAR-T細(xì)胞的殺傷表型。

02  在長(zhǎng)期持續(xù)抗原刺激下檢測(cè)Vβ8-CAR-T細(xì)胞增殖、維持和殺傷能力。

03  在免疫缺陷小鼠模型中驗(yàn)證Vβ8-CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效果。

04  對(duì)靶向Vβ5的CAR-T細(xì)胞殺傷表型進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，拓寬策略適用范圍。

05  檢測(cè)特定亞型Vβ的T細(xì)胞缺失后對(duì)適應(yīng)性免疫的影響，驗(yàn)證CAR-T治療策略安全性。

研究?jī)?nèi)容
 

 首先，作者利用能夠特異性識(shí)別TCR β鏈可變區(qū)不同V區(qū)結(jié)構(gòu)域（Vβ8, Vβ5, Vβ13）的抗體，分析其氨基酸序列后提煉出相應(yīng)的單鏈可變片段（single-chain variable fragment, scFv），并將該序列與4-1BB和CD3ζ序列整合構(gòu)建CAR，用激活的原代T細(xì)胞制備靶向不同Vβ亞型的CAR-T細(xì)胞。對(duì)這些CAR-T細(xì)胞自身分別檢測(cè)特定Vβ亞型陽(yáng)性率，發(fā)現(xiàn)這些CAR-T細(xì)胞確實(shí)能特異性消除各自靶向的Vβ亞型陽(yáng)性的正常T細(xì)胞，而對(duì)總Tαβ表達(dá)沒(méi)有影響。將Vβ8特異的CAR-T細(xì)胞與正常T細(xì)胞共培養(yǎng)后，Vβ8⁺ T細(xì)胞類群比例明顯下降，并且上清檢測(cè)出細(xì)胞毒性相關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α分泌顯著增多。

 

接下來(lái)，作者利用293細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞分別構(gòu)建配對(duì)的Vβ8^-和Vβ8⁺細(xì)胞，并與對(duì)照T細(xì)胞或Vβ8-CAR-T細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)Vβ8⁺細(xì)胞與Vβ8-CAR-T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，才能檢測(cè)到T細(xì)胞IFN-γ、TNF-α的釋放，以及granzyme B的表達(dá)，Vβ8⁺ Jurkat細(xì)胞才能被特異性殺傷，并且激活的caspase-3表達(dá)水平顯著上升，表明細(xì)胞凋亡增加。

 

 

為了檢測(cè)CAR-T細(xì)胞長(zhǎng)期增殖和細(xì)胞毒性殺傷能力，作者利用輻照的Vβ8⁺ Raji細(xì)胞作為抗原持續(xù)重復(fù)刺激Vβ8-CAR-T細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)多個(gè)不同供體來(lái)源的CAR-T細(xì)胞，作者發(fā)現(xiàn)這種重復(fù)的抗原刺激能夠不斷增加Vβ8-CAR-T細(xì)胞數(shù)目，無(wú)需為T(mén)細(xì)胞擴(kuò)增做額外的基因改造，也沒(méi)有出現(xiàn)靶向CD3或CD5的CAR-T細(xì)胞中互相殺傷的現(xiàn)象。而細(xì)胞毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照T細(xì)胞相比，不同刺激階段的Vβ8-CAR-T細(xì)胞均能顯著提升對(duì)Vβ8⁺ Jurkat細(xì)胞的殺傷。

 

 

作者進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證Vβ8-CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效果，他們用免疫缺陷的NSG小鼠建立Jurkat細(xì)胞異種移植模型，靜脈注射對(duì)照T細(xì)胞或者Vβ8-CAR-T細(xì)胞，結(jié)果表明經(jīng)Vβ8-CAR-T細(xì)胞治療的小鼠，流式檢測(cè)其外周血、脾臟和骨髓中的腫瘤細(xì)胞數(shù)目明顯降低，活體成像顯示各時(shí)間點(diǎn)腫瘤負(fù)荷明顯減少，總生存率顯著提升。

 

 

利用Vβ8靶點(diǎn)證明靶向Vβ的策略有效后，作者并不滿足于此，希望將適用范圍拓展到其他T淋巴細(xì)胞腫瘤。為此，作者構(gòu)建了Vβ5-CAR-T細(xì)胞，以及Vβ5陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞CCRF-CEM和Hut-78 T細(xì)胞系。與靶向Vβ8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，在Vβ5-CAR-T細(xì)胞制備的過(guò)程中，自身表達(dá)Vβ5的正常T細(xì)胞被清除。體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，Vβ5-CAR-T細(xì)胞能夠特異性殺傷Vβ5⁺的CCRF-CEM和Hut-78 T細(xì)胞，并且僅在它與Vβ5⁺細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)分泌IFNγ。同樣在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，Vβ5-CAR-T細(xì)胞注射能夠顯著降低Vβ5⁺的CCRF-CEM異種移植腫瘤負(fù)荷，并且顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期。

 

 

靶向Vβ的策略雖然顯示較好的抗腫瘤效果，但仍存在一定風(fēng)險(xiǎn)，CAR-T細(xì)胞會(huì)攻擊自身表達(dá)所靶向Vβ亞型的正常T細(xì)胞，故作者接下來(lái)對(duì)這一策略安全性進(jìn)行評(píng)估。因?yàn)轶w內(nèi)某特定Vβ亞型的T細(xì)胞僅占所有T細(xì)胞的一小部分，作者猜測(cè)相比于靶向所有T細(xì)胞（例如CD5、CD7或CD3）的CAR-T治療策略，這一小部分T細(xì)胞的缺失不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制。為了驗(yàn)證這一猜想，作者建立了選擇性去除Vβ8⁺ T細(xì)胞的小鼠模型。Vβ8特異性抗體的檢測(cè)表明小鼠中Vβ8⁺ T細(xì)胞約占總正常T細(xì)胞的21.5%。作者利用相同scFv片段制備Vβ8重組抗體，模擬長(zhǎng)期Vβ8⁺ T細(xì)胞的缺失，并用CD3ε抗體處理的小鼠作為陽(yáng)性對(duì)照。

 

隨后作者對(duì)該小鼠模型注射DEC-OVA疫苗，發(fā)現(xiàn)Vβ8抗體處理的小鼠產(chǎn)生DEC-OVA抗體的水平，以及OT-I特異的T細(xì)胞應(yīng)答水平與野生型小鼠類似，而CD3ε抗體處理的小鼠產(chǎn)生的DEC-OVA抗體顯著減少，OT-I特異的T細(xì)胞應(yīng)答則完全被抑制。作者進(jìn)一步對(duì)接種B16-OVA腫瘤細(xì)胞的小鼠進(jìn)行抗腫瘤免疫檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Vβ8⁺ T細(xì)胞缺失小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線與野生型小鼠基本一致，而由CD3ε抗體處理后所有T細(xì)胞缺失的小鼠腫瘤生長(zhǎng)更加迅速。因此Vβ8⁺ T細(xì)胞缺失的小鼠細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)幾乎不受影響。

 

 

 綜上所述，文章利用TCR β鏈可變區(qū)的特定亞型作為靶點(diǎn)，建立特異性的CAR-T細(xì)胞治療策略，并證明該策略能夠有效殺傷特定亞型的T細(xì)胞惡性腫瘤，同時(shí)保留充分的適應(yīng)性免疫功能，對(duì)臨床有一定的指導(dǎo)意義。

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