?肝臟是脊椎動(dòng)物消化系統(tǒng)中的一個(gè)器官，以代謝功能為主，并扮演著去毒素、氧化、肝糖原儲(chǔ)存、合成分泌性蛋白等重要角色。肝臟直接或間接地參與多個(gè)重要代謝途徑，與多種遺傳性疾病有關(guān)，目前已有幾百種與肝臟相關(guān)的單基因疾病的報(bào)道。因此，越來(lái)越多的科學(xué)家聚焦于借助先進(jìn)技術(shù)展開對(duì)靶向肝臟的基因治療。

圖1 肝臟結(jié)構(gòu)（PMID: 32483353）
 

得益于病毒載體的發(fā)展，借助病毒載體進(jìn)行靶向肝臟的基因水平或細(xì)胞水平操作已成為科學(xué)家研究熱點(diǎn)。

重組腺相關(guān)病毒載體（recombinant Adeno-associated virus, rAAV）和腺病毒載體（Adenovirus）均能高效感染肝臟組織。其中腺病毒的強(qiáng)嗜肝性特點(diǎn)使其被廣泛用于肝臟的研究中，相較于其他病毒載體，腺病毒載體具有容量大、快速表達(dá)、高效轉(zhuǎn)導(dǎo)等優(yōu)勢(shì)，但腺病毒免疫原性強(qiáng)，感染劇烈，故常會(huì)引起動(dòng)物局部組織炎癥反應(yīng)和機(jī)體免疫反應(yīng)，對(duì)動(dòng)物體征和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀性造成影響。

rAAV載體是表達(dá)基因序列的理想載體，具有血清型種類多樣、免疫原性低、長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)基因、宿主范圍廣等優(yōu)勢(shì)，在基因功能研究和基因治療遞送載體中占據(jù)主導(dǎo)地位。
 

01  rAAV載體血清型的選擇

AAV2是第一個(gè)被報(bào)道用于體內(nèi)基因遞送的載體，其可以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細(xì)胞。隨后，一些常用血清型（AAV8、AAV9、AAV5、AAV3、AAV-DJ）及AAVhu.37、AAVrh.8等AAV血清型載體被發(fā)現(xiàn)可以高效轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠肝臟，其中AAV8血清型在小鼠肝臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高（有報(bào)道稱通過(guò)靜脈注射對(duì)肝臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)率為90%以上），且在肝臟中表達(dá)時(shí)間更長(zhǎng)，此外，scAAV8可實(shí)現(xiàn)快速、高效、穩(wěn)定、安全表達(dá)的目的。另有研究者發(fā)現(xiàn)，AAV8血清型體外轉(zhuǎn)導(dǎo)人肝細(xì)胞效果較差。研究者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)去選擇合適的病毒載體。

圖2 不同AAV血清型對(duì)肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)率比較（PMID: 19861950）

感染效果圖

圖3 九游會(huì)j9生物測(cè)試AAV8血清型靜脈注射感染肝臟結(jié)果

九游會(huì)j9生物可提供AAV1-9、AAV-DJ、AAVrh10等幾十種AAV血清型病毒包裝服務(wù)。

02  啟動(dòng)子選擇

肝臟中細(xì)胞類型主要分為兩類：實(shí)質(zhì)細(xì)胞（parenchymal cells）和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（nonparenchymal cells），其中，實(shí)質(zhì)細(xì)胞約占肝臟體積的70-80%。肝細(xì)胞（Hepatocyte）是肝臟中最主要的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，是肝臟基本功能單位—肝小葉的細(xì)胞構(gòu)成，也是肝臟功能的主要承擔(dān)者，具有調(diào)節(jié)代謝、解毒的作用，參與蛋白質(zhì)合成及儲(chǔ)存、碳水化合物轉(zhuǎn)換、膽汁的合成與分泌。因此開發(fā)高效、特異靶向肝細(xì)胞的工具尤為重要。目前，較為常用的肝細(xì)胞特異性啟動(dòng)子為：TBG和Alb。此外，在肝臟組成中，還包含肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cells, HSCs，也叫Ito細(xì)胞）、Kupffer細(xì)胞（ Kupffer cell, KC）和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（liver sinusoidal endothelial cells,LSECs）等。

表一 常用肝細(xì)胞特異性啟動(dòng)子

感染效果圖

圖4 九游會(huì)j9生物測(cè)試TBG和Alb啟動(dòng)子尾靜脈注射感染肝細(xì)胞結(jié)果

九游會(huì)j9生物可提供CBh、CAG、CMV、EF1a等廣泛表達(dá)啟動(dòng)子，亦可提供靶向肝細(xì)胞的TBG和Alb特異性啟動(dòng)子，幫助您構(gòu)建高效、特異性靶向肝臟的rAAV載體。

03  注射方式及注射劑量

進(jìn)入肝臟的血管有肝動(dòng)脈和門靜脈。肝動(dòng)脈發(fā)自腹腔動(dòng)脈干輸送富含氧氣的血液；門靜脈引消化道（腸胃、胰腺、脾臟）的靜脈血，輸送富含消化營(yíng)養(yǎng)的血液。出肝臟的血液通過(guò)肝靜脈，匯入后腔靜脈。

基于肝臟的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，靶向肝臟的rAAV載體遞送方式主要分為直接注射和系統(tǒng)注射。

表二 靶向肝臟的rAAV載體遞送方式

• 表中注射用量為：成年小鼠注射劑量。

圖5 靶向肝臟注射方式（PMID: 30783984）

注射操作視頻請(qǐng)點(diǎn)擊文末閱讀原文

04  應(yīng)用案例

• 借助rAAV2/8載體攜帶TBG啟動(dòng)子通過(guò)尾靜脈注射可特異性感染肝臟，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝臟疾病的機(jī)制研究。

圖6 AAV8-TBG感染肝臟（PMID: 35100024）

• 借助rAAV2/8載體進(jìn)行肝臟的基因水平調(diào)控，在肝骨營(yíng)養(yǎng)不良(HOD)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的肝-骨軸，涉及肝臟PP2Acα的上調(diào)，導(dǎo)致肝因子卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)的表達(dá)減少，以及膽固醇從骨到肝臟的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷。（詳情請(qǐng)點(diǎn)擊【Cell Metab.】肝-骨軸缺陷促進(jìn)肝性骨營(yíng)養(yǎng)不良疾病的進(jìn)展）

圖7 AAV8感染肝臟（PMID: 35235775）

參考文獻(xiàn)
[1] Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2020 Aug;17(8):457-472. DOI: 10.1038/s41575-020-0304-x
[2] Mol Ther. 2010 Jan;18(1):118-25. DOI: 10.1038/mt.2009.246
[3] Methods Mol Biol. 2019;1950:333-360. DOI: 10.1007/978-1-4939-9139-6_20
[4] Methods Mol Biol. 2011;807:141-57. DOI: 10.1007/978-1-61779-370-7_6
[5] Genes (Basel). 2020 Aug 10;11(8):915. DOI: 10.3390/genes11080915
[6] Expert Opin Biol Ther. 2021 Jun;21(6):749-766. DOI: 10.1080/14712598.2021.1865303
[7] Circulation . 2022 Feb;145(5):375-391. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.121.055600
[8] Cell Metab. 2022 Mar 1;34(3):441-457.e7. DOI: 10.1016/j.cmet.2022.02.006