大家好，這里是只想咕咕的椰球。8月為大家?guī)?lái)的是一篇來(lái)自Cell Reports的研究。論文的標(biāo)題很好地概括了這篇研究的主要內(nèi)容，抑制膽堿能中間神經(jīng)元增強(qiáng)直接通路中等多棘神經(jīng)元的皮層-紋狀體突觸傳輸從而改善帕金森綜合征動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)。本文的作者均來(lái)自法國(guó)的艾克斯－馬賽大學(xué)。
 

在之前的解讀文章中，九游會(huì)j9已經(jīng)介紹了細(xì)胞特異性（cell-type specific）研究在神經(jīng)環(huán)路研究領(lǐng)域的基本思路和手段（具體內(nèi)容可回顧往期文章：【Cell Reports】細(xì)胞特異性研究揭示前島葉皮層VIP中間神經(jīng)元在適應(yīng)性行為中的作用）。通過(guò)遺傳學(xué)等手段，細(xì)胞特異性研究可以針對(duì)性地關(guān)注某一群特征一致的神經(jīng)元的活動(dòng)規(guī)律和生理功能。而本文的研究者所關(guān)注的是紋狀體中膽堿能中間神經(jīng)元對(duì)直接通路中等多棘神經(jīng)元這一特異性投射在帕金森病中所發(fā)揮的作用。因此可以認(rèn)為本文的研究達(dá)到了“投射特異性”水平。
 

在本文中，作者在離體（腦片）和在體兩個(gè)層面，利用光遺傳學(xué)、化學(xué)遺傳學(xué)操縱結(jié)合電生理、動(dòng)物行為學(xué)等技術(shù)揭示了這條膽堿能投射通路對(duì)直接通路中等多棘神經(jīng)元的突觸傳遞和突觸可塑性的調(diào)控作用，暗示膽堿能系統(tǒng)對(duì)紋狀體神經(jīng)元的調(diào)控可能依賴于多巴胺輸入的整合。

引言
 

本文涉及了紋狀體中兩類不同神經(jīng)元：膽堿能中間神經(jīng)元和中等多棘神經(jīng)元。作為基底神經(jīng)節(jié)的重要輸入結(jié)構(gòu)，紋狀體中占絕對(duì)主導(dǎo)地位的是一類名為“中等多棘神經(jīng)元（medium spiny neurons，MSNs）”的GABA能神經(jīng)元。MSNs廣泛接受來(lái)自于皮層、丘腦的谷氨酸輸入以及來(lái)自黑質(zhì)的多巴胺輸入，并與基底神經(jīng)節(jié)的輸出結(jié)構(gòu)相連參與運(yùn)動(dòng)控制（圖 1左）。MSNs可以被分為兩類：膜表面表達(dá)Ⅰ型多巴胺受體的D1-MSNs直接投射向黑質(zhì)網(wǎng)狀部/內(nèi)側(cè)蒼白球等基底神經(jīng)節(jié)的輸出結(jié)構(gòu)，這條投射通路被稱為直接通路（direct pathway），本文中研究的直接通路MSNs就是這類細(xì)胞；而表達(dá)Ⅱ型多巴胺受體的D2-MSNs則通過(guò)外側(cè)蒼白球、丘腦底核等核團(tuán)與基底神經(jīng)節(jié)的輸出結(jié)構(gòu)間接相連，因此被稱為間接通路（indirect pathway）。多巴胺作用于D1-MSNs可以激活其活動(dòng)但作用于D2-MSNs則會(huì)抑制間接通路的活動(dòng)，直接通路和間接通路依賴于多巴胺調(diào)控的活動(dòng)平衡被認(rèn)為是基底神經(jīng)節(jié)運(yùn)動(dòng)控制的重要基。ㄍ 1中）。在帕金森病中，由于黑質(zhì)中多巴胺神經(jīng)元大量死亡，缺少多巴胺輸入的兩條通路活動(dòng)逐漸失衡從而導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙的發(fā)生（圖 1右）。

圖1 基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路和帕金森病的經(jīng)典模型（McGregor and Nelson，2019）

除了MSNs外，紋狀體中還有少量的GABA能和膽堿能中間神經(jīng)元。這兩種中間神經(jīng)元占比都不高（據(jù)估計(jì)只有1%-2%），它們主要投射向局部的MSNs并對(duì)MSNs的活動(dòng)起到調(diào)控作用。在本文中，研究者關(guān)注的是紋狀體中的膽堿能中間神經(jīng)元（cholinergic interneurons，CINs），這類神經(jīng)元因其以穩(wěn)定的頻率持續(xù)放電也被稱為緊張性發(fā)放神經(jīng)元（tonically active neurons，TANs）。以往的研究顯示，當(dāng)獎(jiǎng)賞或者運(yùn)動(dòng)事件出現(xiàn)時(shí)CINs的緊張性發(fā)放會(huì)出現(xiàn)短暫的停頓，研究者普遍認(rèn)為CINs可以通過(guò)這種方式改變紋狀體中乙酰膽堿的濃度從而在運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)或抉擇中發(fā)揮調(diào)控作用。然而在帕金森病中，CINs卻失去了通過(guò)暫停調(diào)控神經(jīng)活動(dòng)的能力。本文作者之前的研究發(fā)現(xiàn)，使用光遺傳手段在帕金森模型小鼠中抑制CINs活動(dòng)可以選擇性地影響皮層經(jīng)直接通路誘發(fā)的黑質(zhì)神經(jīng)元反應(yīng)，這提示紋狀體膽堿能神經(jīng)元對(duì)直接通路MSNs的調(diào)控作用。然而，CINs向MSNs的膽堿能投射是如何影響皮層-紋狀體信息處理通路的，在帕金森病過(guò)程中這種調(diào)節(jié)作用又會(huì)發(fā)生怎樣的改變，依然值得進(jìn)一步探索。

結(jié)果

為了在操縱紋狀體CINs活動(dòng)的同時(shí)對(duì)D1-MSNs進(jìn)行記錄，研究者首先建立了轉(zhuǎn)基因工具鼠品系。利用Cre-loxp系統(tǒng)（關(guān)于Cre-loxp系統(tǒng)的應(yīng)用可以參考文章：又見(jiàn)Cre！Cre/Loxp系統(tǒng)應(yīng)用全攻略 | 知識(shí)點(diǎn)分享），研究者將ChAT-cre與Rosa-NpHR鼠雜交從而在膽堿能神經(jīng)元中特異性表達(dá)抑制性光敏蛋白NpHR，然后再與D1-tdTomato鼠雜交從而使得D1-MSNs中特異性表達(dá)紅色熒光。

在急性分離的紋狀體腦片中，研究者使用全細(xì)胞膜片鉗方式鉗制表達(dá)了紅色熒光的D1-MSNs，并在皮層施加電刺激以誘發(fā)MSNs產(chǎn)生突觸后電位，同時(shí)使用585 nm光刺激以抑制CINs的活動(dòng)（圖 2A）。記錄結(jié)果表明，在非帕金森鼠的腦片中，光刺激未能顯著改變D1-MSNs的興奮性突觸后電位（excitatory post-synaptic potentials，EPSPs）和配對(duì)脈沖比（paired-pulse ratio，PPR）（圖 2B）。然而，在單側(cè)注射6-OHDA誘導(dǎo)帕金森模型的工具鼠所制備的腦片中，光刺激時(shí)記錄到的誘發(fā)的EPSPs的幅度顯著高于無(wú)光刺激，然而光照依然未使得PPR表現(xiàn)出顯著變化（圖 2C）。以上發(fā)現(xiàn)提示當(dāng)紋狀體失去多巴胺支配后，短暫抑制CINs活動(dòng)可以增強(qiáng)直接通路MSNs中皮層-紋狀體的突觸傳輸。

圖2 6-OHDA模型動(dòng)物中D1-MSNs皮層-紋狀體EPSPs得到增強(qiáng)

光照導(dǎo)致EPSPs的幅度增強(qiáng)而PPR未發(fā)生改變提示了6-OHDA損傷可能對(duì)D1-MSNs突觸后活動(dòng)產(chǎn)生了影響。因此研究者接下來(lái)檢測(cè)了特異性表達(dá)在D1-MSNs膜上的M4代謝型乙酰膽堿受體（M4 mAChRs）是否參與了膽堿能神經(jīng)元對(duì)MSNs的調(diào)控。使用M4 mAChRs的抑制劑托吡卡胺（tropicamide）孵育腦片，研究者發(fā)現(xiàn)D1-MSNs中的誘發(fā)EPSPs出現(xiàn)了顯著的上升（圖 3A）。同樣地，在托吡卡胺存在的條件下抑制CINs的活動(dòng)并未對(duì)D1-MSNs的誘發(fā)EPSPs產(chǎn)生顯著影響（圖 3B），這提示M4 mAChRs可能參與CINs對(duì)皮層-紋狀體突觸傳輸?shù)恼{(diào)控。

下一步，研究者想到由于M4 mAChRs是一種G蛋白偶聯(lián)受體，激活Gαi偶聯(lián)的M4 mAChRs將會(huì)抑制蛋白激酶A（PKA）的活動(dòng)。因此PKA途徑可能參與了膽堿能神經(jīng)元對(duì)MSNs的突觸后調(diào)控。為了驗(yàn)證這一假說(shuō)，研究者將PKA的抑制劑（PKI）加載在電極內(nèi)液中導(dǎo)入D1-MSNs。在電極內(nèi)液中存在PKI的條件下，EPSPs幅度并未因光抑制CINs而出現(xiàn)上升（圖 3C和3D），提示在帕金森模型鼠中，CINs通過(guò)M4 mAChRs及PKA途徑調(diào)控皮層-紋狀體的突觸傳輸。

圖3 在6-OHDA模型鼠中，M4 mAChR和PKA介導(dǎo)了D1-MSNs中光抑制CIN導(dǎo)致的皮層-紋狀體EPSPs的上升

與此同時(shí)，研究者還提出了另外一個(gè)問(wèn)題：為什么在6-OHDA模型鼠中，抑制CINs活動(dòng)可以導(dǎo)致皮層-紋狀體突出傳輸?shù)母淖?，而在正常工具鼠中卻檢測(cè)不到這種改變？6-OHDA注射可以殺死黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元，從而解除對(duì)MSNs和CINs的支配，這種改變是否影響了D1-MSNs膜表面M4 mAChR的表達(dá)量或者M(jìn)4 mAChR對(duì)乙酰膽堿的親和力？為了探索這個(gè)問(wèn)題，作者分別使用流式熒光分選技術(shù)（FACS-sorting）和G蛋白激活的鉀通道（GIRK2）對(duì)這兩個(gè)問(wèn)題進(jìn)行了探索。結(jié)果顯示6-OHDA模型鼠中的M4 mAChR的mRNA水平相比健康鼠雖然數(shù)值上略高于，但并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)上的區(qū)別（圖 3E）。另外M4 mAChR對(duì)于內(nèi)源乙酰膽堿的敏感性也未發(fā)生顯著的變化（圖 3F）。因此6-OHDA注射所導(dǎo)致的變化更有可能發(fā)生在CINs而不是MSNs上。

以上結(jié)果在腦片上證實(shí)了在帕金森模型鼠中光抑制CIN活動(dòng)可以調(diào)控皮層-紋狀體的突觸傳輸。接下來(lái)研究者希望通過(guò)在體水平的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證這一現(xiàn)象。首先研究者構(gòu)建了一套在體誘導(dǎo)MSNs產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potential, LTP）范式。依然采用上文提到過(guò)的轉(zhuǎn)基因工具鼠模型，利用在體胞內(nèi)記錄手段，研究者對(duì)背側(cè)紋狀體（主要接受來(lái)自感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮層輸入）細(xì)胞進(jìn)行了記錄。在膜電位的下降相，研究者對(duì)細(xì)胞注入去極化電流的同時(shí)使用短暫的高頻電刺激以誘發(fā)LTP的產(chǎn)生（圖 4A）。另外，研究者還檢驗(yàn)了光刺激對(duì)CINs活動(dòng)的抑制效果，結(jié)果表明光照可以強(qiáng)烈抑制紋狀體CINs的放電，而在光照后CINs的活動(dòng)出現(xiàn)了大幅度的反彈（圖 4B）。

驗(yàn)證范式成立后，研究者分別檢測(cè)了未損傷、6-OHDA模型和6-OHDA模型+CIN抑制三種情況下MSNs的LTP誘發(fā)情況。在未損傷狀態(tài)下，高頻電刺激后EPSP斜率隨時(shí)間表現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)，提示LTP被成功誘發(fā)（圖 4C，灰色）。而在6-OHDA帕金森模型動(dòng)物中，EPSP斜率完全不隨時(shí)間變化，表明在帕金森模型動(dòng)物中皮層-紋狀體的突觸可塑性遭到破壞（圖 4C，綠色）。最后，在6-OHDA模型動(dòng)物中使用光抑制CIN活動(dòng)使得EPSP斜率出現(xiàn)了小幅上升，雖然不及未損傷動(dòng)物的程度，但是顯著高于無(wú)光刺激的模型動(dòng)物（圖 4C，黃色）。以上結(jié)果表明，光抑制CINs活動(dòng)可以部分恢復(fù)帕金森動(dòng)物中的LTP作用。

圖4 在帕金森模型鼠中光抑制CIN活動(dòng)可以部分恢復(fù)皮層-紋狀體的在體長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用

在本文的最后，研究者檢驗(yàn)了抑制紋狀體CINs活動(dòng)對(duì)動(dòng)物行為表型的改變。作為一個(gè)高水平的研究，從細(xì)胞層面過(guò)度到行為層面從而形成研究層次的完整是必需的。為了檢驗(yàn)抑制CIN對(duì)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力的影響，研究者使用加速轉(zhuǎn)棒（Rota-Rod）實(shí)驗(yàn)作為運(yùn)動(dòng)技巧學(xué)習(xí)的范式，并且采用化學(xué)遺傳的方式對(duì)CINs的活動(dòng)進(jìn)行了操縱。首先研究者還是在電生理水平驗(yàn)證了化學(xué)遺傳抑制的效果。在ChAT-cre鼠的紋狀體注射cre依賴的受體hM4Di（巧合的是hM4Di正是從乙酰膽堿受體上改造而來(lái)），給予CNO后研究者發(fā)現(xiàn)CINs的放電頻率出現(xiàn)了顯著的下降，并且可以維持30 min以上（圖 5B）。接下來(lái)，作者分別在6-OHDA模型動(dòng)物的紋狀體注射攜帶了hM4Di或空載的AAV病毒，未損傷的sham動(dòng)物也在紋狀體注射了含空載體的AAV病毒作為對(duì)照（圖 5C）。研究者對(duì)這三組動(dòng)物進(jìn)行了轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)的訓(xùn)練和測(cè)試，結(jié)果不出意外，注射了對(duì)照病毒的6-OHDA模型動(dòng)物從轉(zhuǎn)棒上跌落的速度最快，表現(xiàn)出最短的掉棒潛伏期（latency to fall）。而未損傷動(dòng)物則表現(xiàn)出最長(zhǎng)的掉棒潛伏期，雖然只有150 s（圖5D，灰色）。而在轉(zhuǎn)棒測(cè)試前給予CNO化學(xué)遺傳抑制CINs活動(dòng)使得動(dòng)物的掉棒潛伏期顯著高于6-OHDA模型鼠（圖5D，黃色）。以上結(jié)果表明抑制CINs活動(dòng)可以改善帕金森模型鼠的運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)能力，這與上文電生理記錄的結(jié)果是一致的。

圖5 在6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森模型動(dòng)物中使用化學(xué)遺傳抑制CINs活動(dòng)可以增強(qiáng)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)技巧學(xué)習(xí)能力

尾聲

本文雖然篇幅不長(zhǎng)（只有四個(gè)figure），但是基本遵循了九游會(huì)j9之前所提到的環(huán)路研究思路（由于是投射特異性研究，本文不需要示蹤實(shí)驗(yàn)，但是記錄和操縱實(shí)驗(yàn)貫穿始終），內(nèi)容扎實(shí)，從細(xì)胞到行為水平一應(yīng)俱全。尤其是研究者在腦片和在體研究中所采用的范式難度不。逑殖雋搜芯空吒叱牡縞砉Φ。當(dāng)然不可否認(rèn)的是，作者在主要研究?jī)?nèi)容中依然未能解答6-OHDA損傷是如何改變紋狀體CINs-MSNs環(huán)路從而導(dǎo)致調(diào)控模式產(chǎn)生變化的這一問(wèn)題。雖然九游會(huì)j9可以推測(cè)這一改變與多巴胺系統(tǒng)的缺失有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，但是其具體路徑依然非常值得關(guān)注。

參考文獻(xiàn)

[1] McGregor M M, Nelson A B. Circuit mechanisms of Parkinson’s disease[J]. Neuron, 2019, 101(6): 1042-1056.