大家好，這里是只想咕咕的椰球。今天為大家?guī)硪黄p松有趣的論文，標(biāo)題為生酮飲食在阿爾茨海默小鼠模型中緩解認(rèn)知損傷并減輕炎癥反應(yīng)。本文刊載于Wiley旗下的雜志CNS neuroscience & therapeutic。自2008年創(chuàng)立以來，這本刊物的影響因子一直不溫不火地徘徊在3-4的區(qū)間。但是從18-19年開始本刊發(fā)展勢(shì)頭迅猛，影響因子一路上漲，截至今年已經(jīng)突破7。本文的第一作者許云龍博士和通訊作者朱英杰研究員均來自中科院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院。
 

引言
 

“生酮飲食”是近幾年非常受關(guān)注的一種膳食減肥策略，指的是一種嚴(yán)格的低碳水，高脂肪飲食方式。所謂“生酮”指的就是產(chǎn)生酮體（以丙酮酸和β-羥基丁酸為主），用脂肪代謝產(chǎn)生的酮體而不是葡萄糖為身體供能。自上世紀(jì)20年代被引入，生酮飲食已經(jīng)被證明是一種有效的應(yīng)對(duì)兒童難治性癲癇的療法。目前生酮飲食治療癲癇的原理尚未明確，不過科學(xué)家普遍認(rèn)為生酮飲食可以增加體內(nèi)γ-氨基丁酸（GABA）水平從而降低神經(jīng)元興奮度，同時(shí)還具備調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。除此之外其他研究也表明，生酮飲食可以起到抗炎、抗氧化等神經(jīng)保護(hù)作用，這提示生酮飲食除了可以治療癲癇，還有可能對(duì)其他神經(jīng)退行性疾病產(chǎn)生保護(hù)和治療作用。

阿爾茨海默。ˋlzheimer's disease，AD）是世界第一大神經(jīng)退行性疾。脅著數(shù)千萬老齡人群的身體健康和生活質(zhì)量。AD的發(fā)病機(jī)理仍未完全清楚，但是普遍認(rèn)為和神經(jīng)炎癥存在千絲萬縷的聯(lián)系。因此生酮飲食作為治療阿爾茨海默病的療法，其潛力值得探索。

在本文中，研究者探討了生酮飲食對(duì)阿爾茨海默模型小鼠的治療作用。利用5xFAD模型鼠以及多種行為學(xué)、組織學(xué)手段，作者發(fā)現(xiàn)生酮飲食干預(yù)可以顯著減輕AD模型鼠的神經(jīng)炎癥，阻止AD模型鼠神經(jīng)元和突觸的丟失從而減輕AD模型鼠的認(rèn)知功能損傷。

結(jié)果

為了在模式動(dòng)物中模擬阿爾茨海默病的病理特征，多種AD動(dòng)物模型已經(jīng)被開發(fā)出來。目前最廣泛被使用AD動(dòng)物模型是轉(zhuǎn)基因小鼠模型。如APP/PS1、3xTG等攜帶AD致病突變體的轉(zhuǎn)基因小鼠模型都已經(jīng)為人熟知了。在本研究中作者使用的5xFAD鼠攜帶了5種人源的家族性AD相關(guān)突變基因，屬于AD疾病進(jìn)展最快的轉(zhuǎn)基因鼠模型之一。在本文的研究中，模型動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物被分為3組，分別為AD+KD（模型鼠+生酮飲食）、AD+SD（模型鼠+標(biāo)準(zhǔn)飲食）和WT+SD（野生型鼠+標(biāo)準(zhǔn)飲食），是一個(gè)比較標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)組+陽(yáng)性對(duì)照+陰性對(duì)照的分組設(shè)計(jì)。飲食干預(yù)從動(dòng)物7月齡時(shí)開始，此時(shí)5xFAD鼠已經(jīng)表現(xiàn)出了嚴(yán)重的AD表型（圖 1A）。在連續(xù)四個(gè)月對(duì)模型鼠進(jìn)行生酮飲食干預(yù)后，研究者使用不同的行為學(xué)范式對(duì)各組動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶和運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行了測(cè)試。
 

圖1 本文實(shí)驗(yàn)流程圖，包含飲食干預(yù)和行為測(cè)試

首先，作者使用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open filed test，OFT）檢驗(yàn)了各組小鼠的運(yùn)動(dòng)能力和焦慮水平。結(jié)果表明三組動(dòng)物在曠場(chǎng)中的平均運(yùn)動(dòng)速度和總運(yùn)動(dòng)距離未表現(xiàn)出顯著差別（圖 2A和B），這提示動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力和運(yùn)動(dòng)意愿均未因品系和飲食干預(yù)而發(fā)生顯著改變。同時(shí)三組動(dòng)物在曠場(chǎng)中心活動(dòng)的時(shí)間和進(jìn)入曠場(chǎng)中心的次數(shù)也未表現(xiàn)出顯著區(qū)別，這表明不同品系動(dòng)物或不同飲食干預(yù)均未對(duì)動(dòng)物的焦慮水平產(chǎn)生顯著影響。
 

圖2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同飲食干預(yù)的AD模型鼠和野生鼠的運(yùn)動(dòng)能力和焦慮水平

在確認(rèn)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)和情緒水平未受改變后，研究者對(duì)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行了檢驗(yàn)。

當(dāng)研究動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力時(shí)九游會(huì)j9通常會(huì)設(shè)置“一長(zhǎng)一短”兩種行為范式。具體而言，九游會(huì)j9分別需要分別設(shè)置一個(gè)長(zhǎng)期記憶（參考記憶）科目和一個(gè)短期記憶（工作記憶）科目，通過兩種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果交叉驗(yàn)證從而闡明不同組別動(dòng)物之間學(xué)習(xí)記憶能力的差別。

在本研究中，作者使用Barnes迷宮對(duì)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測(cè)試（圖 3B）。Barnes迷宮可以被看為是Morris水迷宮的陸地版，相比水迷宮實(shí)驗(yàn)，Barnes迷宮對(duì)動(dòng)物的體能消耗更。锏撓に揭哺。另外，研究者選用T迷宮作為工作記憶的范式（圖 3F）。T迷宮，或者與其相似的Y迷宮都是檢驗(yàn)動(dòng)物工作記憶的常用范式。研究者在本文設(shè)計(jì)了一個(gè)“延遲非配對(duì)”任務(wù)訓(xùn)練動(dòng)物在兩次連續(xù)的試驗(yàn)中分別向迷宮的兩臂移動(dòng)。

Barnes迷宮的結(jié)果表明，經(jīng)過8天的訓(xùn)練后，野生型鼠和以生酮飲食喂養(yǎng)的AD模型鼠的平均逃避潛伏期均降至50s以內(nèi)，而正常飲食的AD模型鼠逃避潛伏期依然保持在100s以上（圖 3C）。在空間探索測(cè)試中，AD模型鼠首次進(jìn)入藏身洞的時(shí)間顯著長(zhǎng)于野生鼠，在目標(biāo)象限探索的時(shí)間比例也顯著短于野生鼠（圖 3D和3E）。然而，使用生酮飲食干預(yù)則使得AD模型鼠在Barnes迷宮的兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)中均優(yōu)于普通飲食組模型鼠。

同時(shí)，T迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與Barnes迷宮的結(jié)果相吻合。普通飲食處理的AD模型鼠在任務(wù)正確率上顯著低于野生型對(duì)照鼠，而生酮飲食組AD模型鼠在T迷宮中的任務(wù)正確率則相比普通飲食組存在顯著的提升（圖 3G）。

綜上，在AD模型鼠發(fā)病之后采取生酮飲食干預(yù)使得模型鼠的認(rèn)知障礙癥狀得到了顯著的緩解，提示生酮飲食治療AD導(dǎo)致認(rèn)知損傷治療方案的潛力。
 

圖3 生酮飲食可以緩解5xFAD模型鼠的認(rèn)知功能損傷

除了認(rèn)知障礙外，皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元的丟失和突觸的損傷也是AD的典型癥狀。因此研究者接下來在檢驗(yàn)了生酮飲食干預(yù)對(duì)神經(jīng)元和突觸的保護(hù)效果。首先，作者分別使用突觸素（Synaptophysin）和PSD95兩種抗體對(duì)海馬齒狀回組織的切片進(jìn)行免疫熒光染色。突觸素是突觸前小泡的標(biāo)志蛋白，而PSD95是突觸后致密帶蛋白，兩種抗體分別代表了突觸的兩個(gè)組成部分。結(jié)果顯示，無論是突觸素還是PSD95，在AD模型鼠中量的相比野生鼠均顯示出顯著的下降，表明隨著AD病程的進(jìn)展所表現(xiàn)出的突觸缺失（圖 4A和C）。而在生酮飲食干預(yù)的AD模型鼠中兩種標(biāo)志蛋白的斑塊數(shù)量相比普通飲食的模型鼠均表現(xiàn)出一定的回升（圖 4B和D），提示生酮飲食干預(yù)可以部分阻止5xFAD鼠中突觸的損傷。

同時(shí)，使用成熟神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN免疫熒光染色，研究者還檢驗(yàn)了生酮飲食對(duì)AD模型鼠中神經(jīng)元丟失的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，11月齡的5xFAD鼠中發(fā)生了神經(jīng)元大量缺失的現(xiàn)象，而生酮飲食則在一定程度上抑制了NeuN陽(yáng)性細(xì)胞丟失的現(xiàn)象（圖 4E-H）。

為了判定突觸的缺失原發(fā)還是是由神經(jīng)元死亡所導(dǎo)致的，研究者使用高爾基銀染的辦法對(duì)皮層和海馬區(qū)幸存神經(jīng)元樹突的形態(tài)進(jìn)行了觀察（圖 4I）。結(jié)果表明AD模型鼠中單位長(zhǎng)度樹突棘的密度顯著低于野生鼠，而在生酮飲食處理的AD模型鼠中樹突棘的密度則得到了有效的恢復(fù)（圖 4J）。以上結(jié)果進(jìn)一步證明生酮飲食可以在一定程度上阻止AD模型鼠中突觸和神經(jīng)元的損傷。
 

圖4 生酮飲食阻止了AD模型鼠中神經(jīng)元和突觸的丟失

除了細(xì)胞丟失和認(rèn)知障礙外，AD的典型病理特征還包括β-淀粉樣蛋白（β amyloid，Aβ）的沉積、tau蛋白的纏結(jié)以及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活等。因此在接下來的研究中，作者對(duì)這幾項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)。免疫熒光結(jié)果表明，普通飲食組AD模型鼠中出現(xiàn)了大量Aβ斑塊積累，而生酮飲食處理的AD模型鼠中Aβ斑塊的面積則顯著更小（圖 5A和B）。小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1染色的結(jié)果表明AD模型鼠中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活水平顯著高于野生鼠，形態(tài)也顯著膨大（圖5C和E）；而生酮飲食處理的AD模型鼠中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活水平和形態(tài)則與野生鼠相當(dāng)（圖 5C和D）。同時(shí)，研究者還檢查了腦組織中部分炎性因子的表達(dá)水平，ELISA結(jié)果顯示在皮層和海馬兩個(gè)腦區(qū)中，生酮飲食干預(yù)均可以顯著減輕AD模型引發(fā)的IL-1β和TNF-α表達(dá)量的上升（圖 5G-5J）。
 

圖5 生酮飲食可以減輕5xFAD小鼠中 Aβ的沉積和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化

綜上，本文使用阿爾茨海默模型小鼠，通過多種行為學(xué)和病理手段檢測(cè)了生酮飲食法對(duì)阿爾茨海默模型小鼠的治療作用。本文的研究?jī)?nèi)容并不復(fù)雜，但是研究和行文的思路清晰，所采用的研究方法全面包含了阿爾茨海默藥效研究的各個(gè)方面。九游會(huì)j9將本文中所采用的動(dòng)物模型和研究方法整理在下表中，希望對(duì)有AD相關(guān)療法評(píng)篩需求的朋友們有所幫助。