論文標(biāo)題：Induction of m6A methylation in adipocyte exosomal LncRNAs mediates myeloma drug resistance
刊登日期：2022年01月
發(fā)表雜志：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research
影響因子：12.658
研究機(jī)構(gòu)：休斯頓衛(wèi)理公會(huì)癌癥中心，休斯頓衛(wèi)理公會(huì)研究所，廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院癌癥研究中心，德克薩斯大學(xué)安德森癌癥中心血液學(xué)系
技術(shù)手段：m6A測序、聯(lián)川生物OmicStudio云平臺(tái)
文章架構(gòu)
主要研究內(nèi)容
1、來自MM患者脂肪細(xì)胞的外泌體對(duì)化療誘導(dǎo)的MM細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用
圖1
該研究首先從正常骨髓（NADs）和多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者骨髓（PtADs）中分離出脂肪細(xì)胞，利用透射電鏡觀察到從脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液上清中收集到的外泌體呈杯狀。隨后將MM細(xì)胞與外泌體共培養(yǎng)，利用共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)被標(biāo)記上Dil的外泌體存在于MM細(xì)胞的細(xì)胞膜上，并在胞漿內(nèi)移動(dòng)，表明脂肪細(xì)胞外泌體能夠被MM細(xì)胞吸收。 該研究還發(fā)現(xiàn)NADs和PtADs的外泌體均能抑制化療藥物bortezomib(BTZ)誘導(dǎo)的MM細(xì)胞凋亡，其中PtADs外泌體的抑制作用更明顯。說明脂肪細(xì)胞外泌體對(duì)MM耐藥性具有潛在影響。
圖2
將幾種MM細(xì)胞系及對(duì)應(yīng)化療藥物與MM相關(guān)脂肪細(xì)胞（MMADs）中的外泌體共培養(yǎng)，NADs外泌體作為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NADs相比，MMDAs外泌體顯著降低了化療藥物的治療效果。表明MM細(xì)胞可能增強(qiáng)脂肪細(xì)胞外泌體對(duì)MM細(xì)胞化療耐藥性的影響。
2、脂肪細(xì)胞外泌體攜帶的lncRNAs抑制MM細(xì)胞凋亡
圖3
與NADs外泌體的lncRNAs相比，MMADs外泌體的lncRNAs（LOC606724和SNHG1）顯著上調(diào)。利用MMRF CoMMpass RNA-seq數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)LOC606724和SNHG1的表達(dá)與患者總生存期呈顯著正相關(guān)。并且在MM細(xì)胞中過表達(dá)或敲除這兩個(gè)lncRNAs可分別抑制或增強(qiáng)化療藥物的療效。表明MMADs外泌體攜帶的lncRNAs對(duì)化療誘導(dǎo)的MM細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。
圖4
SNHG1已被證明參與調(diào)控腫瘤生長，作者后續(xù)對(duì)LOC606724如何調(diào)控MM細(xì)胞凋亡進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)或敲除脂肪細(xì)胞中的LOC606724可分別使MMADs中的癌蛋白c-Myc顯著上調(diào)或下調(diào)，但不影響c-Myc mRNAs表達(dá)。表明LOC606724在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)MM細(xì)胞中的c-Myc蛋白。
elF4E是蛋白翻譯中的關(guān)鍵分子，通過RIP檢測，發(fā)現(xiàn)c-Myc蛋白可與elF4E蛋白結(jié)合，并顯著富集于過表達(dá)LOC606724的MM細(xì)胞，而過表達(dá)c-Myc可抑制化療藥物的療效。表明LOC606724通過結(jié)合elF4E參與介導(dǎo)c-Myc蛋白合成。
3、MM細(xì)胞促進(jìn)IncRNA向脂肪細(xì)胞外泌體富集
圖5
通過分析NADs和MMADs在細(xì)胞或外泌體中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)外泌體中的lncRNAs顯著上調(diào)，并且MMADs外泌體中的lncRNAs水平明顯高于NADs。利用RNA pull-down實(shí)驗(yàn)檢測到lncRNAs包裝至外泌體中所需的RNA結(jié)合蛋白（hnRNPA2B1和hnRNPU）。利用這兩個(gè)蛋白的抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)lncRNAs在MMADs中顯著富集。利用siRNAs下調(diào)MMADs中的這兩個(gè)蛋白后，可使MMADs外泌體中的lncRNAs下調(diào)，并誘導(dǎo)更多的MM細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明，MM細(xì)胞可促進(jìn)脂肪細(xì)胞中與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合的lncRNAs被包裝到外泌體中。
4、脂肪細(xì)胞中METTL7A介導(dǎo)的lncRNAs m6A甲基化的鑒定
圖6
使用MeRIP-seq對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行研究，與NADs相比，MMADs中存在lncRNAs的甲基化。然后通過lncRNAs pull-down實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MMADs裂解物中存在METTL7A。RIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)LOC606724富集于METTL7A。 隨后作者通過構(gòu)建和純化His標(biāo)記的重組METTL7A融合蛋白，進(jìn)行了體外甲基轉(zhuǎn)移酶活性分析，證實(shí)METTL7A具有m6A甲基轉(zhuǎn)移酶活性，并且酶活性主要來自于METTL7A蛋白76-172 AA。然后作者利用SRAMP軟件發(fā)現(xiàn)LOC606724上存在七個(gè)潛在的m6A motifs，并通過體外甲基化分析發(fā)現(xiàn)METTL7A蛋白可增加含有M5基序的RNA寡核苷酸的m6A水平。其中M5基序位于LOC606724的481nt處并含有AMP，當(dāng)將這個(gè)AMP變?yōu)镚MP后，m6A酶活性明顯降低。這表明METTL7A蛋白的76-172AA與LOC606724的第481位AMP甲基化有關(guān)。
下一步，作者構(gòu)建了MMADs的METTL7A沉默表達(dá)載體（siMETTL7A），通過m6A-RIP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MMADs中的m6A水平顯著降低，lncRNAs對(duì)RNA結(jié)合蛋白的富集度下降，并導(dǎo)致外泌體lncRNAs顯著下調(diào)。將MM細(xì)胞與siMETTL7A-MMADs的外泌體共培養(yǎng)后，MM細(xì)胞凋亡率明顯提高。這些結(jié)果表明，具有甲基化轉(zhuǎn)移酶活性的METTL7A有助于lncRNAs的m6A甲基化，甲基化的lncRNAs可以富集在脂肪細(xì)胞外泌體中。
5、MM細(xì)胞通過EZH2介導(dǎo)的蛋白質(zhì)甲基化增強(qiáng)脂肪細(xì)胞的METTL7A活性
圖7
通過使用抗METTL7A抗體拉下脂肪細(xì)胞裂解物，檢測到MMADs免疫沉淀物中的METTL7A蛋白甲基化水平高于NADs的免疫沉淀物，表明MM細(xì)胞增強(qiáng)了METTL7A蛋白的甲基化。 EZH2是一種賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，可以使組蛋白和非組蛋白甲基化。EZH2在MMADs中的表達(dá)水平高于NADs。作者構(gòu)建的EZH2沉默載體（siEZH2）可使MMADs中的METTL7A蛋白甲基化水平以及l(fā)ncRNAs表達(dá)水平降低，并使化療藥物治療后的MM細(xì)胞凋亡率明顯提升。表明EZH2能夠增強(qiáng)脂肪細(xì)胞中METTL7A活性，從而促進(jìn)lncRNAs甲基化，減少化療后MM細(xì)胞的凋亡率，最終增強(qiáng)MM細(xì)胞的耐藥性。
圖8
接著作者構(gòu)建了PDX模型，注射靶向藥（bortezomib或tazemetostat）兩周后，發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓瘤明顯縮。⒔檔土酥鞠赴餉諤逯衛(wèi)ncRNAs的表達(dá)。構(gòu)建EZH2敲除的MM小鼠模型后，發(fā)現(xiàn)靶向藥治療效果變得更好，并提高了小鼠生存率，而脂肪細(xì)胞中的METTL7A甲基化水平降低。表明脂肪細(xì)胞EZH2對(duì)MM細(xì)胞化療具有潛在作用。
總之，該研究通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MM患者脂肪細(xì)胞中收集的外泌體及其中的lncRNAs (LOC606724和SNHG1)均可抑制化療誘導(dǎo)的MM細(xì)胞凋亡，即增強(qiáng)了骨髓瘤細(xì)胞的耐藥性。通過RIP、MERIP-seq和RNA-Protein pull-down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)lncRNAs可以與METTL7A蛋白互作，同時(shí)證實(shí)了METTL7A具有RNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性；最后研究表明MM細(xì)胞通過EZH2介導(dǎo)的METTL7A蛋白甲基化增強(qiáng)了METTL7A活性，從而促進(jìn)lncRNAs包裝到脂肪細(xì)胞外泌體中。該研究指出了一種通過阻斷外泌體介導(dǎo)的腫瘤惡性循環(huán)來提高癌癥治療效果的潛在策略。
