在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，突觸的傳遞效能會隨著神經(jīng)活動的變化而改變，這稱之為“突觸可塑性”，被認(rèn)為是大腦高級功能學(xué)習(xí)與記憶的細(xì)胞基礎(chǔ)。在大腦海馬CA1興奮性神經(jīng)元中，位于樹突棘（Dendritic spines, 是神經(jīng)元樹突上的微小突起，是興奮性突觸的主要突觸后位點(diǎn)）突觸后膜的AMPA型谷氨酸受體數(shù)量的增加和功能的增強(qiáng)介導(dǎo)了突觸長時程增強(qiáng)（long-term synaptic potentiation，LTP）效應(yīng)，這被稱為是突觸可塑性的經(jīng)典形式。
神經(jīng)元間突觸的信號傳遞與樹突棘的可塑性密切相關(guān)。神經(jīng)信號如何誘導(dǎo)樹突棘產(chǎn)生功能可塑性是一個重要而有趣的神經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)問題。以往大量的研究聚焦于蛋白質(zhì)分子在突觸可塑性中的功能與作用機(jī)制，而對于細(xì)胞中另一類重要的生物大分子―脂質(zhì)分子鮮有涉獵。
中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所劉佳佳研究員團(tuán)隊(duì)借助脂質(zhì)組學(xué)、活細(xì)胞成像、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、RNAi（RNA干擾）技術(shù)、全細(xì)胞膜片鉗記錄、行為學(xué)范式等多個技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)位于興奮性神經(jīng)元樹突胞膜上PI4P的代謝調(diào)控在活動依賴的AMPAR膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中以及在LTP和學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮重要作用，并揭示了活動誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升促進(jìn)了PI4KIIIa向細(xì)胞膜表面募集，進(jìn)而促進(jìn)PI4P的合成過程。相關(guān)研究成果于2022年3月1日刊發(fā)在《Cell Reports》上，標(biāo)題為“Activity-dependent PI4P synthesis by PI4KIIIα regulates long-term synaptic potentiation”。
1.膜脂分子PI4P在海馬神經(jīng)元胞膜上富集
首先，為了明確磷脂酰肌醇4-磷酸（Phosphatidylinositol 4-phosphate, PI4P）在神經(jīng)元中的亞細(xì)胞分布，作者借助免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜中PI4P信號強(qiáng)度明顯高于Neuro-2a（小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞）、NIH/3T3（小鼠成纖維細(xì)胞）和 HeLa（上皮細(xì)胞）。定量分析發(fā)現(xiàn)，PI4P在軸突胞膜中比樹突更豐富（圖1）。
圖1 PI4P在小鼠海馬神經(jīng)元中的亞細(xì)胞分布
2.樹突胞膜中的PI4P水平在LTP過程中發(fā)生動態(tài)可逆變化
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，位于樹突棘的突觸后位點(diǎn)接收了大部分興奮性輸入。為了探索PI4P在突觸傳遞和突觸可塑性中的作用，作者首先研究了PI4P在樹突中的亞細(xì)胞分布和含量是否會隨著神經(jīng)活動發(fā)生動態(tài)變化。在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，研究者借助NMDA受體的共激動劑（co-agonist）甘氨酸化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞的長時程增強(qiáng)（long-term synaptic potentiation，LTP）效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樹突的PI4P信號強(qiáng)度受神經(jīng)元活動的調(diào)節(jié)，其水平在LTP期間經(jīng)歷動態(tài)可逆變化（圖2）。
圖2 樹突胞膜中的PI4P水平在LTP過程中發(fā)生動態(tài)可逆變化
基于上述結(jié)果，作者假設(shè)PI4P參與了活動依賴的突觸后成分的膜轉(zhuǎn)運(yùn)（如AMPA將受體轉(zhuǎn)運(yùn)至突觸位點(diǎn)上），為了驗(yàn)證該假說，首先需要調(diào)控PI4P在胞膜或細(xì)胞內(nèi)膜上的含量。以PI為底物，共有四種激酶可以將其磷酸化為產(chǎn)物PI4P，其中PI4KIIIa被認(rèn)為參與了PI4P在胞膜中的合成和維持。借助化學(xué)抑制劑或AAV介導(dǎo)的shRNA表達(dá)載體（pAKD-CMV-bGlobin-eGFP-H1-PI4KIIIa shRNA），研究者在海馬神經(jīng)元中抑制PI4KIIIa的活性或表達(dá)。結(jié)果顯示，抑制PI4KIIIa可導(dǎo)致樹突胞膜中PI4P缺失。進(jìn)一步地，在化學(xué)誘導(dǎo)LTP的過程中急性給予PI4KIIIa抑制劑可以阻止胞膜上PI4P水平的瞬時性上升。這些結(jié)果提示了，在神經(jīng)元樹突胞膜上，PI4KIIIa既與PI4P靜息狀態(tài)下的含量相關(guān)，也參與了活動依賴的PI4P合成過程。（圖3）。
圖3 PI4KIIIa參與了活動依賴的PI4P合成過程
接下來，研究人員驗(yàn)證了PI4P在活動依賴的AMPAR膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的重要作用，同時，借助免疫染色發(fā)現(xiàn)，樹突上大多數(shù)AMPAR轉(zhuǎn)運(yùn)體并不富含 PI4P，提示了細(xì)胞膜上的PI4P是活動依賴的AMPAR囊泡胞外轉(zhuǎn)運(yùn)所必需的。
隨后，研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CICR（鈣誘導(dǎo)的鈣釋放）促進(jìn)了PI4KIIIa在LTP期間從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞膜表面募集，進(jìn)而介導(dǎo)了PI4P的合成，促進(jìn)AMPAR亞基GluA1在細(xì)胞膜上的運(yùn)輸（圖4）。
上述結(jié)果共同提示了產(chǎn)生LTP的海馬神經(jīng)元中，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升促進(jìn)了PI4KIIIa向細(xì)胞膜表面募集，進(jìn)而促進(jìn)PI4P的合成過程。
圖4 PI4KIIIa定位樹突質(zhì)膜表面，并在LTP誘導(dǎo)下催化合成PI4P
4.沉默PI4KIIIa表達(dá)可抑制LTP和長期記憶
為了研究干擾PI4KIIa或PI4KIIIa是否會影響神經(jīng)元的突觸傳遞，研究人員在成年小鼠海馬CA1區(qū)注射pAKD-CMV-bGlobin-eGFP-H1-PI4KIIa shRNA或pAKD-CMV-bGlobin-eGFP-H1-PI4KIIIa shRNA病毒。全細(xì)胞膜片鉗記錄的結(jié)果顯示，在海馬神經(jīng)元中沉默PI4KIIa或PI4KIIIa沉默導(dǎo)致了AMPAR介導(dǎo)的興奮性突觸后電流（EPSC）發(fā)生了輕度下降（圖5A-F）。
為了研究沉默PI4KIIa或PI4KIIIa是否會影響突觸可塑性，研究人員首先在E14.5的小鼠胚胎中側(cè)腦室注射PI4KIIa或PI4KIIIa的shRNA質(zhì)粒，然后在P14-21之間制備了小鼠的急性腦切片并進(jìn)行電生理記錄。LTP分析顯示，沉默PI4KIIIa不僅顯著降低了LTP的幅度(magnitude)，并且破壞了CA1神經(jīng)元中LTP的維持（圖5M,N）。這些數(shù)據(jù)提示了PI4KIIIa依賴的PI4P合成對于LTP期間的樹突棘的結(jié)構(gòu)和功能可塑性至關(guān)重要。
圖5 沉默PI4KIIa和PI4KIIIa的表達(dá)可抑制LTP
最后，作者借助情境恐懼條件反射和Morris水迷宮行為學(xué)范式發(fā)現(xiàn)，在海馬CA1區(qū)沉默PI4KIIIa表達(dá)可導(dǎo)致小鼠記憶缺陷。提示了，海馬CA1神經(jīng)元中PI4KIIIa依賴的PI4P合成對于學(xué)習(xí)記憶是必需的（圖6）。
上述結(jié)果提示了沉默PI4KIIIa可損害了突觸的長時程增強(qiáng)作用以及動物的記憶能力。
圖6 沉默海馬CA1興奮性神經(jīng)元中PI4KIIIa的表達(dá)導(dǎo)致小鼠記憶缺陷
PI4P是生物膜中的低豐度磷脂分子，但具有調(diào)控脂轉(zhuǎn)移和囊泡運(yùn)輸?shù)戎匾飳W(xué)功能。劉佳佳研究員團(tuán)隊(duì)借助脂質(zhì)組學(xué)、快速活細(xì)胞成像、細(xì)胞生物學(xué)、RNAi（RNA干擾）技術(shù)、全細(xì)胞膜片鉗記錄、行為學(xué)范式等多個技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)膜富含PI4P，在產(chǎn)生LTP的海馬神經(jīng)元中，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升促進(jìn)了PI4KIIIa定位在樹突質(zhì)膜內(nèi)表面，使質(zhì)膜PI4P水平迅速升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制PI4KIIIa活性急性降低質(zhì)膜PI4P水平可完全抑制LTP誘導(dǎo)期的AMPAR質(zhì)膜表達(dá)，而在小鼠大腦海馬CA1區(qū)沉默PI4KIIIa表達(dá)導(dǎo)致突觸的長時程增強(qiáng)作用以及動物的記憶能力受損。該項(xiàng)研究不僅發(fā)現(xiàn)膜脂PI4P的代謝受到神經(jīng)活性調(diào)控，而且揭示了PI4P在AMPAR運(yùn)輸中的調(diào)控作用以及在LTP和學(xué)習(xí)記憶中的生理意義。
劉佳佳實(shí)驗(yàn)室博士生郭真真和南京大學(xué)石云實(shí)驗(yàn)室博士后蔣朝華為該論文的共同第一作者。該研究得到了國家自然科學(xué)基金委、科技部和中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)B的資助。
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