肝骨營養(yǎng)不良(HOD)是一種代謝性骨。Ｓ肼愿尾∠喙，以骨流失和骨質(zhì)疏松為特征。全世界約有8.44億人口，近75%有HOD，患有骨質(zhì)減少或骨質(zhì)疏松癥。2022年3月1日，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院蔣青教授研究團(tuán)隊與南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院薛斌教授團(tuán)隊、南京醫(yī)科大學(xué)李朝軍教授團(tuán)隊、中科院深圳先進(jìn)院陳棣教授團(tuán)隊合作（陸克博士與石天舒博士為本文共同第一作者）在Cell Metabolism上發(fā)表了文章Defects in a liver-bone axis contribute to hepatic osteodystrophy disease progression，發(fā)現(xiàn)在HOD的發(fā)病機制中發(fā)現(xiàn)了一個新的肝-骨軸，涉及肝臟PP2Acα的上調(diào)，導(dǎo)致肝因子卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)的表達(dá)減少，以及膽固醇從骨到肝臟的逆向轉(zhuǎn)運缺陷。（DOI：https://doi.org/10.1016/j.cmet.2022.02.006）
肝臟PP2Acα的上調(diào)與HOD的嚴(yán)重程度相關(guān)
通過對臨床樣本的進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，肝臟PP2Acα的上調(diào)與HOD的程度相關(guān)。通過對HOD模型小鼠進(jìn)行研究分析發(fā)現(xiàn)，HOD小鼠肝臟PP2Acα表達(dá)與人類臨床數(shù)據(jù)趨勢一致（Fig.1）。
Fig. 1 肝臟PP2Acα的上調(diào)與HOD的嚴(yán)重程度相關(guān)
肝特異性PP2Acα缺失可改善HOD小鼠的骨質(zhì)疏松
肝細(xì)胞特異性PP2Acα缺失對CCl4誘導(dǎo)的骨流失具有高度抗性，PP2Acα條敲鼠與Cre對照鼠相比，骨形成維持正常，骨吸收具有明顯抗性（Fig.2）。
Fig.2 肝臟特異性PP2Acα缺失可改善HOD小鼠的骨丟失
肝特異性PP2Acα缺失可使LCAT表達(dá)增加，減輕HOD癥狀
經(jīng)過對動物樣本的比對分析發(fā)現(xiàn)122個差異蛋白，涵蓋細(xì)胞增殖、膽固醇運輸、膽固醇外排和脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白，基于差異表達(dá)模式，篩選出4個基因，同時滿足：參與肝損傷期間分泌的肝特異性蛋白、參與脂質(zhì)代謝和骨穩(wěn)態(tài)及潛在翻譯的價值的蛋白，其中LCAT表達(dá)在PP2Acα條敲鼠與對照小鼠間具有明顯差異。為進(jìn)一步確定LCAT是否可以預(yù)防骨流失，通過利用rAAV8-shLcat干擾Lcat在CCl4誘導(dǎo)的PP2Acα條敲小鼠肝臟的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)小鼠的骨流失水平與對照小鼠幾乎一致，沒有明顯差異，因此PP2Acα條敲小鼠的LCAT上調(diào)有助于緩解骨流失。PP2Acα 條敲肝臟組織中LCAT表達(dá)增加，并且骨髓中LCAT表達(dá)也有增加。由于肝臟中的LCAT表達(dá)明顯比成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞高，所以骨髓中增加的LCAT是由肝臟運輸而來。通過對臨床HOD患者的血清進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)LCAT水平與骨密度成正相關(guān)（Fig.3）。
Fig.3 PP2Acα缺失誘導(dǎo)的肝源性LCAT可改善HOD
PP2Acα通過去磷酸化轉(zhuǎn)錄因子USF1調(diào)控LCAT的表達(dá)
通過分析，USF1作為候選基因，進(jìn)一步確定其在肝細(xì)胞中對Lcat調(diào)控的轉(zhuǎn)錄活性，抑制USF1顯著提高了Lcat mRNA水平，免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)PP2Acα與USF1直接相互作用，PP2Acα參與修飾USF1蛋白的去磷酸化。熒光素酶試驗發(fā)現(xiàn)USF1中Thr153突變完全消除了siPP2Acα對Lcat轉(zhuǎn)錄激活的影響（Fig.4）。
Fig.4 PP2Acα通過去磷酸化轉(zhuǎn)錄因子USF1調(diào)控LCAT的表達(dá)
肝源性LCAT通過調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)改善HOD
LCAT通過增加Runx2、Sp7、Col1a2和Ocn的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，LCAT抑制破骨細(xì)胞中Trap、Ctsk和Oscar的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的形成，從而表明LCAT可能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖。通過給HOD小鼠注射AAV8-Lcat，小鼠骨量顯著上調(diào)，rLCAT結(jié)果與AAV8-Lcat結(jié)果一致（Fig.5）。
Fig.5 肝源性LCAT通過平衡骨穩(wěn)態(tài)改善HOD
LCAT維持適當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)膽固醇水平，以緩解成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的缺陷
研究發(fā)現(xiàn)膽固醇位于小鼠原代破骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，rLCAT可以降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平，且與HPCD作用結(jié)果相似。添加rLCAT可以抑制破骨細(xì)胞的形成及成骨細(xì)胞的分化，膽固醇治療后可逆轉(zhuǎn)rLCAT對破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的抑制作用。因此，膽固醇是LCAT誘導(dǎo)骨形成的原因（Fig.6）。
Fig.6 LCAT維持正常的細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平，緩解骨組織代謝紊亂
LCAT通過促進(jìn)膽固醇逆向運輸，有助于肝損傷HOD恢復(fù)
通過對骨骼到肝臟的反向膽固醇運輸進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)rLCAT與PBS對照組相比較，rLCAT治療48h后，NBD-膽固醇在肝臟中積累。通過體外原代肝細(xì)胞與原代成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞共培養(yǎng)，rLCAT治療組肝細(xì)胞檢測到NBD-膽固醇熒光。PP2Acα缺乏可以改善HOD小鼠肝功能，通過rAAV8-shLcat抑制LCAT的表達(dá)，從而阻礙肝臟功能的恢復(fù)。因此，LCAT可以減輕CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷。通過注射rAAV8-Lcat或rLCAT，在CCl4誘導(dǎo)損傷的HOD小鼠中過表達(dá)LCAT，可以恢復(fù)小鼠的肝功能（Fig.7）。
Fig.7 LCAT通過促進(jìn)逆向膽固醇轉(zhuǎn)運，促進(jìn)HOD的肝臟恢復(fù)
肝臟PP2Acα或血清LCAT水平可作為有用的生物標(biāo)志物，以確定HOD的存在、嚴(yán)重程度或進(jìn)展；另外肝臟PP2Acα或血清LCAT水平還可以作為一個治療靶點，以改善HOD進(jìn)展中的肝損傷和骨流失。
● 九游會j9生物有幸提供研究中使用的AAV8-Lcat及AAV8-shLcat的包裝服務(wù)。
