供稿人：舒易來(lái)團(tuán)隊(duì)

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）官網(wǎng)報(bào)道，超過(guò)全球人口的5%，即4.66億人患有致殘性聽(tīng)力障礙，其中3400萬(wàn)是兒童。盡管研究發(fā)現(xiàn)超過(guò)120個(gè)基因與非綜合征型或綜合征型耳聾相關(guān)（http://hereditary hearing loss.org/），但臨床上對(duì)于遺傳性感音神經(jīng)性聾的治療除了佩戴助聽(tīng)器和植入人工耳蝸等，尚無(wú)任何有效的藥物治療手段。在非綜合征型遺傳性耳聾中，常染色體隱性遺傳性耳聾占80% (Korver et al., 2017)。

對(duì)于隱性遺傳性耳聾，最佳的治療方法是對(duì)基因突變位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)地修復(fù)，進(jìn)而長(zhǎng)久地恢復(fù)聽(tīng)力。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是近年來(lái)興起的新型基因編輯工具，已在疾病的治療中表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。該系統(tǒng)主要由sgRNA和Cas9兩部分組成，二者形成復(fù)合體， sgRNA與靶位點(diǎn)反向互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)定位后，同時(shí)識(shí)別PAM序列，Cas9核酸酶切割DNA，導(dǎo)致DNA發(fā)生斷裂。細(xì)胞內(nèi)主要有兩種DNA損傷修復(fù)機(jī)制，非同源末端連接（Non-homologous end-joining，NHEJ）和同源重組修復(fù)（Homologous recombination，HR）。當(dāng)有外源性DNA模板存在時(shí)，利用HR可以實(shí)現(xiàn)序列的任意精確變換或者定點(diǎn)插入，但其效率不高，尤其在非分裂細(xì)胞中，HR的效率更低，這極大限制了HR在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用。

研究團(tuán)隊(duì)在先前的研究中通過(guò)在同源模板兩側(cè)引入sgRNA的靶位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)了一種以同源臂介導(dǎo)的末端接合（Homology-Mediated End Joining，HMEJ）為基礎(chǔ)的基因敲入策略 (Yao et al., 2017)，在體內(nèi)、體外均實(shí)現(xiàn)了高效而精確的整合（圖1）。HMEJ介導(dǎo)的基因敲入方法為包括基因編輯動(dòng)物模型的建立和遺傳性疾病的精準(zhǔn)靶向基因治療等提供了廣闊的前景。目前，尚無(wú)基于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的HR策略進(jìn)行耳聾基因治療的體內(nèi)研究。

圖1 設(shè)計(jì)HMEJ同源重組治療方案。a 針對(duì)篩選的sgRNA，設(shè)計(jì)HMEJ同源臂。b 基于AAV作為體內(nèi)遞送載體的雙AAV治療體系，其中一個(gè)AAV遞送用于表達(dá)Cas9的載體，另外一個(gè)遞送表達(dá)sgRNA以及攜帶同源臂的載體。

Klhl18^lowf小鼠模型

Klhl18^lowf小鼠模型是指Klhl18 p.V55F發(fā)生錯(cuò)義點(diǎn)突變（Chr9:110455454 C>A），其純合子小鼠表現(xiàn)為第4周開(kāi)始出現(xiàn)以低頻為主的漸進(jìn)性聽(tīng)力下降，隨著年齡增長(zhǎng)，聽(tīng)力下降逐漸累及其它頻率，最后發(fā)展為全頻型嚴(yán)重耳聾，而雜合子小鼠聽(tīng)力正常，表現(xiàn)為隱性遺傳。Klhl18^lowf隱性遺傳性耳聾小鼠模型在形態(tài)學(xué)方面表現(xiàn)為耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞纖毛的形態(tài)異常 (Ingham et al., 2021)。

CRISPR/Cas9-HMEJ體系

該研究首先針對(duì)基因Klhl18^lowf突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)、篩選和構(gòu)建了HMEJ治療體系。在新生小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中進(jìn)行體外sgRNA篩選，發(fā)現(xiàn)sgRNA2的效率較高。將表達(dá)Cas9的質(zhì)粒與攜帶HMEJ同源模板和表達(dá)sgRNA2的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至帶有Klhl18^lowf突變的成纖維細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)明顯得到了的糾正，且sgRNA2不產(chǎn)生明顯的脫靶編輯。

基于CRISPR/Cas9-HMEJ體系體內(nèi)驗(yàn)證
體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)設(shè)計(jì)的HMEJ系統(tǒng)可以精確糾正Klhl18^lowf點(diǎn)突變后，該研究進(jìn)一步在體內(nèi)探索該系統(tǒng)的療效。用雙AAV包裝CRISPR/Cas9-HMEJ基因修復(fù)體系，即AAV9-SaCas9-KKH和AAV-PHP.eB-sgRNA-donor，將其在Klhl18^lowf新生鼠出生后1天（P1）顯微注射至小鼠的內(nèi)耳。在小鼠P14和10周齡時(shí)，體內(nèi)編輯效率檢測(cè)結(jié)果表明，雙AAV治療系統(tǒng)在體成功糾正了Klhl18基因C>A點(diǎn)突變，隨著編輯時(shí)間的延長(zhǎng)，10周齡的修復(fù)效率提高了約3倍，而在未注射耳中，沒(méi)有觀察到明顯的堿基插入、缺失或突變堿基的糾正。通過(guò)掃描電鏡技術(shù)，與野生型小鼠相比，發(fā)現(xiàn)8周齡的未治療純合突變小鼠的內(nèi)毛細(xì)胞最高一排靜纖毛表現(xiàn)為更長(zhǎng)、更細(xì)且頂端成尖細(xì)的錐形，而治療后的小鼠有部分內(nèi)毛細(xì)胞的靜纖毛恢復(fù)正常的形態(tài)，表現(xiàn)為最高一排靜纖毛大部分呈柱形且更短。在治療后小鼠耳蝸的頂圈和中圈，平均約16%的內(nèi)毛細(xì)胞具有正?；蚪咏５睦w毛束形態(tài)。聽(tīng)性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response, ABR）測(cè)試結(jié)果顯示注射AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ治療體系后8周，注射耳的ABR閾值在8、16、24和32 kHz均比未注射耳明顯下降，且治療效果持續(xù)至小鼠24周齡（實(shí)驗(yàn)觀察期）。電生理檢測(cè)結(jié)果顯示，在較長(zhǎng)時(shí)間（200 ms）的去極化脈沖刺激條件下，未注射耳的內(nèi)毛細(xì)胞膜電容與野生型相比明顯下降，而AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ治療體系能將注射耳內(nèi)毛細(xì)胞膜電容恢復(fù)至野生型水平，即治療體系修復(fù)了內(nèi)毛細(xì)胞持續(xù)囊泡釋放功能。

綜上所述，基于CRISPR/Cas9-HMEJ策略可對(duì)體內(nèi)內(nèi)耳毛細(xì)胞中的基因突變位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的糾正，恢復(fù)了耳蝸部分內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛形態(tài)、修復(fù)了內(nèi)毛細(xì)胞持續(xù)囊泡釋放功能并持久改善了Klhl18^lowf隱性遺傳性耳聾小鼠的聽(tīng)覺(jué)功能，為最終在人類(lèi)隱性遺傳性耳聾及其它器官系統(tǒng)隱性遺傳性疾病中實(shí)現(xiàn)安全、持久的基因治療提供了科學(xué)依據(jù)和參考。

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院舒易來(lái)研究員、李華偉教授和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院（深圳）農(nóng)業(yè)基因組研究所左二偉研究員為共同通訊作者，顧晰博士后、胡新德博士后（中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所）和王大奇博士后為共同第一作者。