時(shí)間：2022-01-26 熱度：

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和學(xué)習(xí)誘導(dǎo)的神經(jīng)環(huán)路重構(gòu)都受到基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)控。組蛋白重構(gòu)在生理和病理?xiàng)l件下調(diào)控這類(lèi)基因的表達(dá)起著重要作用，因此，組蛋白重構(gòu)可能成為許多重大腦疾病的潛在藥物靶點(diǎn)。

 

組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶被確認(rèn)為許多神經(jīng)發(fā)育障礙的風(fēng)險(xiǎn)基因。Ash1l是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，屬于三胸家族（trxG）蛋白的成員之一，其能拮抗多梳蛋白家族對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制功能。目前越來(lái)越多的研究證明，Ash1l基因功能缺失是自閉癥譜系障礙（autism spectrum disorder, ASD）發(fā)生的首要危險(xiǎn)因素，然而，關(guān)于Ash1l單倍體不足導(dǎo)致與 ASD相關(guān)致病機(jī)制尚不清楚。

2022年1月26日，上？萍即笱蒲в爰際躚г管吉松教授團(tuán)隊(duì)利用Ash1l缺失小鼠模型、行為學(xué)范式、光遺傳學(xué)等多個(gè)技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)Ash1l單倍體不足導(dǎo)致小鼠ASD樣行為，破壞活動(dòng)依賴(lài)的突觸修剪過(guò)程，并對(duì)該現(xiàn)象進(jìn)行了系統(tǒng)性探索，相關(guān)研究成果刊發(fā)在神經(jīng)科學(xué)頂級(jí)期刊Neuron上，標(biāo)題為ASH1L haploinsufficiency results in autistic-like phenotypes in mice and links Eph receptor gene to autism spectrum disorder

 

 

結(jié)果

 

 

前腦神經(jīng)元Ash1l單倍體不足導(dǎo)致小鼠的ASD樣表型

 

首先，作者比較了Ash1l^+/-小鼠[1,2]和WT小鼠的行為學(xué)表型，在Ash1l^+/-小鼠中檢測(cè)到了單倍體不足，同時(shí)，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（the open-field test）和埋珠實(shí)驗(yàn)（the marble-burying test）行為學(xué)范式結(jié)果顯示，Ash1l^+/-小鼠表現(xiàn)類(lèi)似焦慮、重復(fù)刻板的行為（圖1A,B）。此外，對(duì)出生后7-9天（P7-P9）小鼠進(jìn)行幼鼠超聲發(fā)聲測(cè)試，發(fā)現(xiàn)Ash1l^+/-小鼠在生命早期存在現(xiàn)溝通障礙的現(xiàn)象（圖1C）。三箱社交實(shí)驗(yàn)（three-chamber assay）結(jié)果顯示Ash1l^+/-小鼠也表現(xiàn)出社交障礙（圖1D）。這些結(jié)果提示了Ash1l突變小鼠表現(xiàn)出典型的自閉癥樣行為，包括溝通困難，重復(fù)刻板行為、社交障礙等。

 

單細(xì)胞基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中， Ash1l優(yōu)先在神經(jīng)元中表達(dá)（圖1E）。因此，研究人員借助原位雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR-FISH）做進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在皮層神經(jīng)元中，Ash1l陽(yáng)性信號(hào)與Map2陽(yáng)性信號(hào)（(Map2⁺，神經(jīng)元標(biāo)志物）高度重疊（圖1F）；在Map2^-細(xì)胞中，Ash1l信號(hào)點(diǎn)數(shù)量明顯減少。這提示了神經(jīng)元中Ash1l功能缺失可能導(dǎo)致自閉癥譜系障礙 (Autism Spectrum Disorder, ASD）樣行為。

 

基于上述結(jié)果，作者構(gòu)建Ash1l^Emx1-cKO小鼠（特異性在前腦，特別是新皮層和海馬區(qū)敲除Ash1l,圖1G-I），并通過(guò)行為學(xué)范式發(fā)現(xiàn)，前腦Ash1l單倍體不足導(dǎo)致小鼠ASD樣行為（圖1J-L）。
 

圖1 Ash1l單倍體不足導(dǎo)致小鼠的ASD樣表型

 

 

Ash1l突變小鼠存在辨別能力缺陷

 

接下來(lái)，研究人員對(duì)Ash1l缺失小鼠的學(xué)習(xí)行為進(jìn)行評(píng)估，借助條件性恐懼反射范式發(fā)現(xiàn)，Ash1l^+/-小鼠和WT小鼠均學(xué)會(huì)了情境性恐懼條件反射，并表現(xiàn)出類(lèi)似的恐懼記憶重提水平，然而Ash1l^+/-小鼠在恐懼學(xué)習(xí)的第三天表現(xiàn)出木僵行為（freezing, 老鼠的一種防御反應(yīng)）下降；此外，在Ash1l^+/-小鼠中未觀察到兩種不同環(huán)境下的木僵行為差異（WT小鼠在context A中表現(xiàn)出較高的木僵行為，在context B（新環(huán)境）中表現(xiàn)出較低的木僵行為），提示了Ash1l^+/-小鼠辨別能力受損（圖2A,B）。

 

在音調(diào)依賴(lài)的辨別范式（圖2C-E）和基于音調(diào)的Go-No-go行為范式（圖2F-H）中，Ash1l^+/-小鼠同樣表現(xiàn)出明顯的聽(tīng)覺(jué)辨別障礙（聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)（ABR）測(cè)試Ash1l^+/-小鼠無(wú)明顯的聽(tīng)力損失）。

 

為了驗(yàn)證前腦神經(jīng)元中Ash1l缺失是否會(huì)導(dǎo)致與Ash1l^+/-小鼠類(lèi)似的辨別能力障礙現(xiàn)象，作者借助Ash1l^Emx1-cKO小鼠進(jìn)行相關(guān)行為學(xué)范式，發(fā)現(xiàn)Ash1l^Emx1-cKO小鼠與恐懼記憶相關(guān)的聽(tīng)覺(jué)辨別能力明顯受損（圖2J,K）。這種Ash1l突變小鼠的辨別能力異常符合部分ASD患者的臨床表現(xiàn)。前腦Ash1l缺失可導(dǎo)致突觸和神經(jīng)環(huán)路功能障礙，以及辨別行為障礙。
 

 

圖2 Ash1l^+/-小鼠表現(xiàn)出正常的學(xué)習(xí)能力，但辨別能力受損

 

 

Ash1l以細(xì)胞自主效應(yīng)的方式介導(dǎo)活動(dòng)依賴(lài)的突觸修剪過(guò)程

 

隨后，作者借助高爾基染色發(fā)現(xiàn)，1月齡的Ash1l^+/-小鼠皮層神經(jīng)元和背側(cè)紋狀體中棘神經(jīng)元（MSNs）的樹(shù)突棘密度顯著增加（圖3A），為研究這種現(xiàn)象是否源于突觸消除過(guò)程（synapse elimination）的減少，研究人員研究了Ash1^+/-小鼠原代皮層神經(jīng)元的突觸密度變化。用表達(dá)ChR2光敏蛋白的慢病毒載體（Lenti-CaMKIIa-ChR2）感染培養(yǎng)的神經(jīng)元，并用LED刺激（圖3B），發(fā)現(xiàn)WT神經(jīng)元在LED刺激后24h樹(shù)突突觸素（SYP）密度顯著降低，而Ash1l^+/-組則未觀察到這種現(xiàn)象（圖3C,D），提示了Ash1l可能介導(dǎo)了活動(dòng)依賴(lài)的突觸修剪過(guò)程?；铙w成像結(jié)果顯示，Ash1l^+/-組培養(yǎng)的神經(jīng)元中，活性依賴(lài)的突觸消除過(guò)程被削弱。

 

此外，作者還研究了在小鼠新皮層中活性依賴(lài)的突觸消除，追蹤了聽(tīng)覺(jué)皮層（auditory cortex, AUD）到后頂葉皮層（posterior parietal cortex, PTLp）長(zhǎng)距離投射軸突的變化。研究人員將AAV-EF1a-DIO-EYFP注射在Rbp4-Cre小鼠AUD，特異性標(biāo)記聽(tīng)覺(jué)皮層L5神經(jīng)元（圖3H）。小鼠接受音調(diào)依賴(lài)的恐懼條件訓(xùn)練，成像觀察軸突變化發(fā)現(xiàn)，聲調(diào)依賴(lài)的恐懼條件學(xué)習(xí)24h后，Ash1l^+/-::Rbp4-Cre小鼠“bouton”（突觸小結(jié)）的清除明顯低于WT小鼠，而“bouton”形成則保持不變（圖3H-J）。

 

為探究這種“突觸修剪”過(guò)程的缺失是否由Ash1l缺失神經(jīng)元的細(xì)胞自主效應(yīng)導(dǎo)致的，研究人員將AAV-hSyn-Cre和AAV-EF1a-DIO-EYFP注射于Ash1l^fl/fl小鼠右側(cè)AUD區(qū)（圖3K），對(duì)小鼠進(jìn)行音調(diào)依賴(lài)的恐懼條件行為學(xué)范式訓(xùn)練，在學(xué)習(xí)之后借助體內(nèi)成像技術(shù)追蹤突觸的變化，發(fā)現(xiàn)Ash1l缺失的神經(jīng)元中學(xué)習(xí)依賴(lài)的突觸的增加數(shù)量沒(méi)有發(fā)生改變，而學(xué)習(xí)誘發(fā)的突觸的減少數(shù)量顯著低于正常小鼠（圖3K-M）。這些數(shù)據(jù)提示了Ash1l以細(xì)胞自主效應(yīng)的方式介導(dǎo)皮層神經(jīng)元的活動(dòng)依賴(lài)的突觸修剪過(guò)程。
 

 

圖3 Ash1l以細(xì)胞自主效應(yīng)的方式介導(dǎo)活動(dòng)依賴(lài)的突觸修剪過(guò)程

 

 

Ash1l調(diào)控幼鼠和成年小鼠中EphA7的表達(dá)

 

接下來(lái)，作者研究了其分子機(jī)制，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組分析及基因本體論（GO）分析發(fā)現(xiàn)，Eph受體EphA7在聽(tīng)覺(jué)皮層和背側(cè)紋狀體中的表達(dá)均顯著下調(diào)（圖4A-C），基于此，研究人員進(jìn)一步將EphA7作為參與Ash1l介導(dǎo)的突觸修剪過(guò)程的重要基因之一進(jìn)行了研究。

 

Eph受體及其配體 Ephrin 統(tǒng)稱(chēng)為Eph家族蛋白，是蛋白酪氨酸激酶家族中的最大成員。Eph/ephrin蛋白作為細(xì)胞表面分子，參與調(diào)節(jié)突觸的形成及神經(jīng)元的可塑性，EphA7是編碼Eph受體中14個(gè)受體蛋白基因之一，在皮質(zhì)發(fā)育和突觸功能中發(fā)揮重要作用。

 

隨后，研究人員借助音調(diào)依賴(lài)的恐懼條件行為學(xué)范式，在體內(nèi)/體外均發(fā)現(xiàn)Ash1l^+/-小鼠聽(tīng)覺(jué)皮層活動(dòng)依賴(lài)的神經(jīng)元中EphA7表達(dá)遠(yuǎn)低于WT小鼠的（圖4D-I），提示了在Ash1l^+/-小鼠中EphA7活動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)受損。
 

 

圖4 Ash1l調(diào)控幼鼠和成年小鼠中EphA7的表達(dá)

 

 

Ash1l通過(guò)拮抗EZH2-H3K27me3來(lái)調(diào)控EphA7的表達(dá)

 

進(jìn)一步，作者探究Ash1l是如何參與調(diào)控EphA7活動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ChIP）發(fā)現(xiàn)，Ash1l的直接靶點(diǎn)H3K36me2在WT和Ash1l^+/-小鼠AUD EphA7基因位點(diǎn)附近沒(méi)有明顯差異，然而H3K27me3信號(hào)（組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體PRC2催化的抑制性標(biāo)記物）在Ash1l^+/-小鼠EphA7基因位點(diǎn)顯著增加（圖5A,B）。同時(shí)，Ash1l^+/-小鼠中H3K27ac（一個(gè)活躍的增強(qiáng)標(biāo)記。H3K27ac與H3K27me3共享一個(gè)位置，存在拮抗作用。）表達(dá)持續(xù)下降，用NaB（組蛋白去乙?；敢种苿?/span>預(yù)處理培養(yǎng)的神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)，刺激Ash1l^+/-神經(jīng)元后H3K27ac升高，EphA7表達(dá)恢復(fù)（圖5C,D）。同樣地，行為學(xué)結(jié)果顯示，Ash1l^+/-小鼠中H3K27me3、EZH2（PRC2復(fù)合體的一個(gè)重要的催化酶）表達(dá)水平顯著增加（圖5E-G）。通過(guò)UNC1999（EZH1/2抑制劑）對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)Ash1l^+/-激活的神經(jīng)元中EphA7表達(dá)受到抑制的現(xiàn)象得到改善（圖5I）。上述結(jié)果提示了，Ash1l在活性依賴(lài)的PRC2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制累積中發(fā)揮拮抗作用，從而允許EphA7在激活的神經(jīng)元中表達(dá)。

 

圖5 Ash1l通過(guò)拮抗EZH2-H3K27me3沉默來(lái)調(diào)控EphA7的表達(dá)

 

 

EphA7高表達(dá)可改善Ash1l^+/-小鼠突觸修剪過(guò)程缺陷和行為異常

 

基于上述結(jié)果，研究人員研究了提高EphA7受體活性是否能改善Ash1l突變小鼠的突觸修剪過(guò)程缺陷和行為異常。Ephrin-A5是EphA7的高親和力配體，參與下游信號(hào)[3,4]。作者在培養(yǎng)的神經(jīng)元和小鼠聽(tīng)覺(jué)皮層中應(yīng)用Ephrin-A5多聚體的Fc融合蛋白（Ephrin-A5 Fc）直接刺激EphA7活性[5,6]，發(fā)現(xiàn)改善了Ash1l突變小鼠的突觸修剪過(guò)程和行為異常（圖6）。
 

 

圖6 Ephrin-A5激活EphA7高表達(dá)Ash1l^+/-小鼠突觸修剪過(guò)程缺陷和行為異常

 

 

 

結(jié)論

本文借助轉(zhuǎn)基因模型鼠、多種行為學(xué)范式、光遺傳學(xué)技術(shù)、活體成像轉(zhuǎn)錄組分析及基因本體論分析等多種技術(shù)手段，研究發(fā)現(xiàn)前腦神經(jīng)元Ash1l單倍體不足可導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生溝通困難、重復(fù)刻板行為、社交障礙等類(lèi)似自閉癥樣表型，并機(jī)制上破壞活動(dòng)依賴(lài)的突觸修剪過(guò)程，這是以細(xì)胞自主效應(yīng)方式介導(dǎo)的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Ash1l可通過(guò)介導(dǎo)EZH2-H3K27me3去抑制作用提高EphA7的活性依賴(lài)表達(dá)，進(jìn)而影響突觸消除過(guò)程，并改善Ash1l^+/-小鼠辨別能力障礙及行為障礙。該研究有助于深入了解ASD相關(guān)發(fā)病機(jī)制，為其干預(yù)治療提供了新的思路。

 

 

 

 

作者介紹及基金信息

 

 

正在上科大管吉松教授課題組進(jìn)行合作研究的2017級(jí)博士研究生閆宇澤(清華大學(xué))和上科大生命學(xué)院的田苗苗博士為本文的共同第一作者。上科大生命學(xué)院研究生 2016級(jí)陳琪楠、2017級(jí)郭修賢、2018級(jí)李萌、2019級(jí)周罡也對(duì)本研究做出了重要貢獻(xiàn)。管吉松教授、青島大學(xué)附屬醫(yī)院劉世國(guó)教授和清華大學(xué)熊巍教授為本文的共同通訊作者，研究得到中科院遺傳發(fā)育所吳青峰研究組、上海理工大學(xué)謝紅研究組的大力支持。研究也得到了上科大戚煒教授、范高峰教授和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院徐楠杰教授大量的有益幫助。

 

該研究受到科技部科技創(chuàng)新2030-重大項(xiàng)目資助，和自然科學(xué)基金項(xiàng)目以及上海市科委項(xiàng)目支持。

 

九游會(huì)j9生物有幸提供實(shí)驗(yàn)中使用的AAV、慢病毒載體，用實(shí)際行動(dòng)助力中國(guó)腦科學(xué)的發(fā)展。

 

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原文鏈接:

https://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(21)01090-4

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參考文獻(xiàn)

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