近年來，飲食干預(yù)是一個(gè)極具吸引力的腫瘤治療策略。目前，主要通過飲食限制卡路里或特殊氨基酸的攝入來達(dá)到抑制腫瘤生長的目的，然而這些方法往往會給患者帶來明顯的體重減輕、疲勞、虛弱等不良反應(yīng)。因此，通過膳食補(bǔ)充特定營養(yǎng)素而不是限制飲食成為新的熱門研究方向，尤其是多不飽和脂肪酸。

2023年12月8日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)/海軍軍醫(yī)大學(xué)王紅陽院士/楊文研究員團(tuán)隊(duì)在Science Advances 雜志以封面形式發(fā)表題為Inhibition of ACLY overcomes cancer immunotherapy resistance via polyunsaturated fatty acids peroxidation and cGAS-STING activation^[1]的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)ATP-檸檬酸裂解酶通過調(diào)節(jié)多不飽和脂肪酸過氧化和cGAS-STING通路，調(diào)控腫瘤免疫的新機(jī)制，并提出了靶向抑制ATP-檸檬酸裂解酶或膳食補(bǔ)充多不飽和脂肪酸打破腫瘤免疫治療抵抗的新策略。
 

論文題目

Science Advances雜志同期還邀請美國賓夕法尼亞大學(xué)免疫學(xué)家Roddy O'Connor博士以Checkmate: Metabolic flexibility with a STING in its tail為題目針對該工作進(jìn)行了焦點(diǎn)評論^[2]。他認(rèn)為，該研究揭示了一種非常有前景的腫瘤聯(lián)合治療策略，可以重振免疫治療耐藥腫瘤中T細(xì)胞的腫瘤殺傷功能。此外，該研究為靶向抑制ATP-檸檬酸裂解酶藥物的研發(fā)和快速、有效的臨床轉(zhuǎn)化提供了強(qiáng)有力的支持。
 

科學(xué)進(jìn)展封面圖為富含omega - 3和omega - 6多不飽和脂肪酸的代表性食物。膳食補(bǔ)充多不飽和脂肪酸有望成為一種克服腫瘤免疫治療抵抗的新策略。（圖源自科學(xué)進(jìn)展）

研究背景

近年來，免疫檢查點(diǎn)抑制劑在腫瘤免疫治療方面取得了巨大的臨床突破，然而由于患者的個(gè)體差異性以及腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，臨床上很多患者對免疫檢查點(diǎn)治療的響應(yīng)性并不好，開發(fā)新的治療策略用以增強(qiáng)免疫治療效果迫在眉睫^[3]。脂質(zhì)合成增強(qiáng)是癌癥的代謝標(biāo)志之一，ATP-檸檬酸裂解酶（ACLY）已被證實(shí)在許多癌癥中高表達(dá)或被激活。2020年，一種新型ACLY抑制劑貝派地酸（BemA）已被FDA批準(zhǔn)用于降低低密度脂蛋白。雖然許多研究證實(shí)靶向抑制ACLY可以抑制癌細(xì)胞增殖，但是ACLY抑制劑在腫瘤免疫治療的作用尚未明確。

現(xiàn)有研究表明多不飽和脂肪酸（PUFAs）顯示出潛在的抗腫瘤功能^[4]，PUFAs不僅可以促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫抑制^[5]，還可以增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫^[6]，在腫瘤免疫中的作用仍存在爭議。此外，補(bǔ)充PUFAs是否通過影響腫瘤細(xì)胞代謝進(jìn)而調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)仍有待進(jìn)一步探究。

研究結(jié)果

為了研究ACLY的特定功能，研究者借助慢病毒載體利用shACLY（LV-shACLY）構(gòu)建了ACLY穩(wěn)定敲低的肝癌細(xì)胞株（Hepa1-6）。研究者將ACLY缺失細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞分別皮下荷瘤接種到免疫缺陷小鼠和免疫功能健全小鼠。結(jié)果顯示，在免疫缺陷小鼠中，抑制ACLY能顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長，但出乎意料的是，在免疫健全小鼠中，抑制ACLY并沒有顯著抑制效果，這提示ACLY缺失引起腫瘤免疫抑制作用。進(jìn)一步流式結(jié)果顯示，ACLY與腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)存在顯著的負(fù)相關(guān)，這一結(jié)果與人肝細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集中ACLY和PD-L1的相關(guān)性一致。此外，與對照腫瘤相比，ACLY缺失腫瘤免疫浸潤的CD8+ T細(xì)胞雖然數(shù)量增加，但其耗竭標(biāo)志物PD-1也隨之上調(diào)。以上結(jié)果表明抑制ACLY 上調(diào)腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)并誘導(dǎo)T細(xì)胞功能障礙。
 

圖1. 抑制ACLY上調(diào)腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)并誘導(dǎo)T細(xì)胞功能障礙

為了探究抑制ACLY 介導(dǎo)的PD-L1上調(diào)和T細(xì)胞功能障礙的機(jī)制，研究者利用TCGA數(shù)據(jù)庫KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)ACLY的表達(dá)與細(xì)胞質(zhì)DNA感應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)呈高度負(fù)相關(guān)。cGAS-STING 通路作為一種經(jīng)典的細(xì)胞質(zhì)DNA 感應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中的 PD-L1 表達(dá)和招募T細(xì)胞在腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究者發(fā)現(xiàn)敲低ACLY上調(diào)了Pan02、B16和Hepa1-6 細(xì)胞中的 cGAS 表達(dá)并誘導(dǎo)下游 STING信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活，提高了Sting、Tbk1和Irf3 蛋白的磷酸化水平。此外，使用ACLY抑制劑BemA處理Hepa1-6細(xì)胞也得到了同樣的結(jié)果；已知cGAS通過產(chǎn)生cGAMP激活下游STING信號，研究者發(fā)現(xiàn)ACLY缺失細(xì)胞產(chǎn)生更多的cGAMP，進(jìn)一步證實(shí)了抑制ACLY能夠激活cGAS。接著，研究者借助慢病毒載體利用CRISPR-Cas9敲除cGAS（LV- CRISPR-Cas9 KO cGAS）構(gòu)建穩(wěn)定cGAS敲除細(xì)胞系，結(jié)果顯示在cGAS敲除組抑制ACLY并不能激活下游STING信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)，排除了抑制ACLY對STING通路激活的非cGAS依賴途徑。
 

圖2. 抑制ACLY激活cGAS-STING

接下來，研究者探究了抑制ACLY誘導(dǎo)的cGAS-STING激活的機(jī)制。理論上講，胞質(zhì)DNA起源于細(xì)胞核或線粒體，研究者從胞質(zhì)提取物中純化了DNA，發(fā)現(xiàn)ACLY缺失細(xì)胞中的胞質(zhì)DNA主要是線粒體DNA（mtDNA）。免疫熒光顯示，ACLY缺失組更多的mtDNA泄露到細(xì)胞質(zhì)中。利用溴化乙錠（EtBr）清除mtDNA后顯著降低了ACLY敲低引起的cGAS-STING激活。此外，抑制ACLY引起線粒體損傷和功能障礙，如耗氧率（OCR）降低以及活性氧（ROS）增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，抑制ACLY引起線粒體損傷和功能障礙，導(dǎo)致mtDNA釋放到胞質(zhì)中激活腫瘤細(xì)胞的cGAS-STING通路。
 

圖3. 抑制ACLY誘導(dǎo)的線粒體損傷觸發(fā)mtDNA泄漏以激活cGAS-STING信號傳導(dǎo)

為了進(jìn)一步探究抑制ACLY如何誘導(dǎo)線粒體損傷，研究者借助液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）脂質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了抑制ACLY促進(jìn)腫瘤細(xì)胞攝取過量的PUFAs。利用PUFAs（ALA、ARA或EPA）處理腫瘤細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)線粒體損傷，線粒體ROS顯著增加。利用CD36抑制劑磺基琥珀酰亞胺油酸酯 （SSO）阻斷PUFAs攝取可有效降低ACLY缺失細(xì)胞中線粒體ROS升高，表明抑制ACLY誘導(dǎo)的線粒體損傷取決于PUFAs的積累。
 

圖4. ACLY抑制導(dǎo)致PUFA過氧化誘導(dǎo)線粒體損傷

研究者隨后在癌癥患者組織中驗(yàn)證了腫瘤ACLY表達(dá)與cGAS-STING激活之間的相關(guān)性。人類HCC臨床樣本中的免疫組織化學(xué)（IHC）染色發(fā)現(xiàn)ACLY和cGAS和PD-L1表達(dá)之間的負(fù)相關(guān)。此外，研究者也觀察到ACLY表達(dá)與人類HCC組織中的CD8+ T細(xì)胞浸潤成反比。這些數(shù)據(jù)表明，低ACLY表達(dá)與人類癌癥中的cGAS-STING激活和T細(xì)胞浸潤有關(guān)。
 

圖5. 低ACLY表達(dá)與人類癌癥中的cGAS-STING激活和T細(xì)胞浸潤相關(guān)

基于上述對于抑制ACLY導(dǎo)致cGAS-STING激活的體外研究，研究者采用原發(fā)性PD-L1抗體治療耐受性腫瘤模型（胰腺癌Pan02），探究抑制ACLY能否提高PD-L1抗體在免疫耐受模型中的治療效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)抑制ACLY或單獨(dú)給予PD-L1抗體對腫瘤生長的影響有限，但抑制ACLY聯(lián)合PD-L1抗體能有顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長。研究者進(jìn)一步采用繼發(fā)性PD-L1治療耐受性腫瘤模型（肝癌Hepa1-6-CD38過表達(dá)細(xì)胞），同樣，ACLY抑制劑BemA顯著增強(qiáng)了PD-L1抗體阻斷的抗腫瘤作用。流式細(xì)胞儀對免疫浸潤的進(jìn)一步分析表明，抑制ACLY和PD-L1抗體聯(lián)合治療促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞浸潤和CD8+ T細(xì)胞分泌IFN-γ和GZMB的功能，同時(shí)降低PD-1+ CD8+ T細(xì)胞的比例。這些結(jié)果表明，聯(lián)合ACLY抑制和免疫檢查點(diǎn)阻斷會顯著增加細(xì)胞毒性T細(xì)胞浸潤，并增強(qiáng)PD-L1抗體治療的抗腫瘤作用。
 

圖6. 抑制ACLY克服PD-L1抗體治療的癌癥耐藥性，這依賴于cGAS

最近，飲食補(bǔ)充PUFAs因其潛在的抗癌作用而受到極大關(guān)注。基于之前的體外研究，研究者提出假設(shè)，膳食PUFAs補(bǔ)充劑是否克服癌癥對免疫治療的耐受，類似于ACLY抑制劑。令人興奮的是，口服PUFAs（ALA或EPA）聯(lián)合PD-L1抗體阻斷使胰腺癌小鼠模型Pan02腫瘤明顯消退，表明膳食補(bǔ)充PUFAs可以逆轉(zhuǎn)腫瘤對免疫療法的耐藥性。
 

圖7. 膳食補(bǔ)充多不飽和脂肪酸協(xié)同增強(qiáng)PD-L1抗體阻斷療效

綜上所述，靶向抑制脂肪酸從頭合成限速酶ATP-檸檬酸裂解酶，驅(qū)動腫瘤細(xì)胞攝入過量多不飽和脂肪酸，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和線粒體損傷，進(jìn)而引起線粒體DNA泄漏，最終激活cGAS-STING先天免疫途徑。該研究揭示了ATP-檸檬酸裂解酶通過調(diào)節(jié)cGAS-STING通路調(diào)控腫瘤免疫的新機(jī)制，更重要的是提供了一種通過靶向抑制ATP-檸檬酸裂解酶或補(bǔ)充多不飽和脂肪酸打破免疫檢查點(diǎn)抑制劑耐受的新策略。
 

模式圖（圖源自科學(xué)進(jìn)展同期焦點(diǎn)評論）

九游會j9助力

九游會j9生物有幸提供實(shí)驗(yàn)中使用的病毒包裝LV-shACLY、LV- CRISPR-Cas9 KO cGAS服務(wù)

參考文獻(xiàn)：
1. Xiang W, Lv H, Xing F, Sun X, Ma Y, Wu L, Lv G, Zong Q, Wang L, Wu Z, Feng Q, Yang W, Wang H. Inhibition of ACLY overcomes cancer immunotherapy resistance via polyunsaturated fatty acids peroxidation and cGAS-STING activation. Sci Adv. 2023 Dec 8;9(49):eadi2465.
2. O'Connor RS. Checkmate: Metabolic flexibility with a STING in its tail. Sci Adv. 2023;9(49):eadm6816. doi:10.1126/sciadv.adm6816
3. E. B. Garon, N. A. Rizvi, R. Hui, N. Leighl, A. S. Balmanoukian, J. P. Eder, A. Patnaik, C. Aggarwal, M. Gubens, L. Horn, E. Carcereny, M.-J. Ahn, E. Felip, J.-S. Lee, M. D. Hellmann, O. Hamid, J. W. Goldman, J.-C. Soria, M. Dolled-Filhart, R. Z. Rutledge, J. Zhang, J. K. Lunceford, R. Rangwala, G. M. Lubiniecki, C. Roach, K. Emancipator, L. Gandhi, K.-. Investigators, Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. N. Engl. J. Med. 372, 2018-2028 (2015).
4. E. Dierge, E. Debock, C. Guilbaud, C. Corbet, E. Mignolet, L. Mignard, E. Bastien, C. Dessy, Y. Larondelle, O. Feron, Peroxidation of n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids in the acidic tumor environment leads to ferroptosis-mediated anticancer effects. Cell Metab. 33, 1701-1715.e1705 (2021).
5. X. Chen, Y. Liu, Y. Wang, C. Wang, X. Chen, Y. Xiong, L. Liu, X. Yuan, H. Tang, C. Shu, J. Zhang, A. M. Guo, H. Chen, J. Yang, CYP4F2-Catalyzed Metabolism of Arachidonic Acid Promotes Stromal Cell-Mediated Immunosuppression in Non-Small Cell Lung Cancer. Cancer Res. 82, 4016-4030 (2022).
6. C. B. Nava Lauson, S. Tiberti, P. A. Corsetto, F. Conte, P. Tyagi, M. Machwirth, S. Ebert, A. Loffreda, L. Scheller, D. Sheta, Z. Mokhtari, T. Peters, A. T. Raman, F. Greco, A. M. Rizzo, A. Beilhack, G. Signore, N. Tumino, P. Vacca, L. A. McDonnell, A. Raimondi, P. D. Greenberg, J. B. Huppa, S. Cardaci, I. Caruana, S. Rodighiero, L. Nezi, T. Manzo, Linoleic acid potentiates CD8(+) T cell metabolic fitness and antitumor immunity. Cell Metab. 35, 633-650.e639 (2023).