時(shí)間：2023-05-26 熱度：

新生兒的器官經(jīng)歷了組織生長(zhǎng)和功能成熟的過程，以適應(yīng)其功能需求和環(huán)境刺激。肝臟是胚胎早期的造血器官，在成年后轉(zhuǎn)變?yōu)橐源x功能為主，并伴有表觀遺傳修飾的廣泛變化。盡管對(duì)于胚胎期細(xì)胞類型鑒定和肝臟器官發(fā)生的初始階段有了一定了解，但對(duì)于出生后肝臟發(fā)育和功能成熟的調(diào)控知之甚少。

 

RNA修飾最近被認(rèn)為是表觀遺傳學(xué)的新關(guān)注點(diǎn)，N⁶-methyladenosine（m6A）是真核生物mRNA上最常見的一種轉(zhuǎn)錄后修飾，介導(dǎo)了超過80%的RNA堿基甲基化。其中甲基化轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase，也叫Writers）是一類重要的催化酶，能夠讓mRNA上的堿基發(fā)生m6A甲基化修飾，而METTL3作為m⁶A甲基化轉(zhuǎn)移酶的核心蛋白參與發(fā)揮重要功能。目前對(duì)于Mettl3在維持某些器官穩(wěn)態(tài)中的作用進(jìn)行了廣泛的研究，然而Mettl3/m⁶A介導(dǎo)的表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)機(jī)制在出生后肝臟發(fā)育中的確切作用仍然存在爭(zhēng)議。

研究成果

2023年5月15日，山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院袁得天教授、高等醫(yī)學(xué)院研究院李石洋教授、武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院夏宇塵教授及德國(guó)海德堡癌癥研究中心Mathias Heikenwalder合作在Nature Metabolism雜志在線發(fā)表新的研究論文“m⁶A modification-tuned sphingolipid metabolism regulates postnatal liver development in male mice”。該項(xiàng)研究揭示了m⁶A修飾的鞘脂代謝可以調(diào)節(jié)小鼠出生后的肝臟發(fā)育和代謝穩(wěn)態(tài)，并探討了Mettl3/m⁶A/Smpd3軸對(duì)鞘脂代謝的精細(xì)調(diào)控。
 

結(jié)果

01  Mettl3在出生后肝臟發(fā)育過程中表達(dá)降低

首先，研究團(tuán)隊(duì)基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和差異基因分析發(fā)現(xiàn)，m⁶A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的核心催化酶Mettl3和Mettl14隨著肝臟發(fā)育過程而表達(dá)下降。其中，Mettl3主要表達(dá)在肝細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)，成年肝臟中肝細(xì)胞的Mettl3的表達(dá)遠(yuǎn)低于胚胎或者新生兒肝臟肝細(xì)胞中的表達(dá)（圖1）。

 

圖1 Mettl3在胚胎和新生兒肝臟中高表達(dá)，并在出生后肝臟發(fā)育過程中下降

 

02  Mettl3參與肝臟發(fā)育和功能成熟

因此，為研究m⁶A修飾在肝臟發(fā)育中的作用，研究者構(gòu)建Mettl3^ΔHep小鼠，胚胎期特異性在肝臟中敲除Mettl3（圖2a,b）。結(jié)果顯示，肝臟Mettl3基因的缺失導(dǎo)致m⁶A RNA水平降低，且Mettl3^ΔHep小鼠在發(fā)育過程中表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩，同時(shí)，Mettl3^ΔHep小鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）升高，肝臟組織表面粗糙，出現(xiàn)肝損傷表型（圖2c-h）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Mettl3^ΔHep小鼠肝臟組織中肝細(xì)胞肥大，細(xì)胞凋亡顯著增加（圖2i-m）。這些結(jié)果提示了特異性在肝臟中敲除Mettl3基因?qū)е赂渭?xì)胞代謝重塑和肝臟功能成熟缺陷。

圖2 肝臟Mettl3缺失導(dǎo)致肝細(xì)胞肥大、肝損傷和生長(zhǎng)遲緩

 

隨后，研究人員借助rAAV2/8-TBG-Cre注射1周齡Mettl3-floxed鼠（AAV8-Cre鼠），條件性敲除肝臟中Mettl3基因，結(jié)果并未觀察到小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的損傷（圖3a-c）。繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，3周齡的AAV8-Cre鼠肝臟m⁶A水平未表現(xiàn)出明顯的降低（圖3d-f）。這提示了Mettl3基因敲除對(duì)肝臟代謝穩(wěn)態(tài)的影響與敲除時(shí)間點(diǎn)有關(guān)，在新生小鼠4周前，Mettl3介導(dǎo)的m⁶A修飾對(duì)于肝臟發(fā)育及功能成熟至關(guān)重要。

圖3 小鼠出生后誘導(dǎo)肝細(xì)胞Mettl3表達(dá)下調(diào)不會(huì)引起肝損傷

 

03  MeMettl3/m⁶A/Smpd3軸對(duì)鞘脂代謝的精細(xì)調(diào)控機(jī)制

為進(jìn)一步確定與發(fā)育缺陷密切相關(guān)的潛在靶基因，研究團(tuán)隊(duì)借助轉(zhuǎn)錄組分析及分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，Mettl3^ΔHep小鼠肝臟中神經(jīng)鞘脂酰胺代謝的中性鞘脂酶Smpd3 mRNA水平和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（圖4）。

圖4 Mettl3^ΔHep小鼠肝臟發(fā)生鞘脂代謝重塑

 

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Mettl3^ΔHep小鼠肝臟中Smpd3 mRNA上的m⁶A修飾水平顯著降低；而AAV8-Cre鼠肝臟中Smpd3轉(zhuǎn)錄水平從出生后4周開始增加，與出生后m⁶A水平呈負(fù)相關(guān)（圖5i-l）。總的來說，小鼠出生后發(fā)育早期的肝臟Mettl3缺失導(dǎo)致Smpd3過早高表達(dá)，這是由于依賴Mettl3介導(dǎo)m⁶A修飾的RNA衰變?nèi)毕菰斐傻?，在新生小鼠4周前，較高水平的Mettl3/m⁶A可作為制動(dòng)器，阻礙了Smpd3的過早表達(dá)（圖5）。

圖5 Mettl3通過m6A修飾調(diào)控smpd3 mRNA衰變

 

接下來，作者探究了鞘脂代謝異常與Mettl3缺乏誘導(dǎo)的肝損傷之間的關(guān)系，借助液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）分析和電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mettl3^ΔHep小鼠肝臟中毒性神經(jīng)酰胺堆積，線粒體損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激升高（圖6）。

圖6 Mettl3^ΔHep小鼠肝臟中毒性神經(jīng)酰胺堆積，線粒體損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激升高

 

04  下調(diào)Smpd3的表達(dá)有效改善肝臟發(fā)育和功能成熟缺陷

基于上述結(jié)果，作者分別借助Smpd3拮抗劑GW4869、Smpd3 siRNA和AAV過表達(dá)Sgms1（pAAV-CBh-Sgms1-3Xflag-P2A-EGFP-WPRE）以抵消Smpd3的方式下調(diào)Smpd3的表達(dá)（圖7a，圖8a），發(fā)現(xiàn)Smpd3表達(dá)降低，可有效逆轉(zhuǎn)由Mettl3缺乏引起的肝損傷，神經(jīng)酰胺堆積、肝線粒體變性和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常得到了改善，小鼠體重也部分恢復(fù)（圖7-8）。

 

圖7 藥理學(xué)手段抑制Smpd3可減輕Mettl3缺陷引起的神經(jīng)酰胺累積和肝損傷表型

 

圖8  Smpd3敲低可減輕肝臟Mettl3缺陷引起的神經(jīng)酰胺累積和肝損傷表型

 

結(jié)論

本文借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)、高通量測(cè)序、轉(zhuǎn)基因小鼠、rAAV載體介導(dǎo)的條件性敲除、分子生物學(xué)等多種技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)Mettl3基因的缺失導(dǎo)致肝細(xì)胞代謝重塑和功能成熟缺陷，且對(duì)肝臟代謝穩(wěn)態(tài)的影響與基因敲除時(shí)間點(diǎn)有關(guān)。Smpd3作為Mettl3的靶標(biāo)，參與鞘脂代謝的調(diào)控。Mettl3缺失導(dǎo)致Smpd3表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而介導(dǎo)鞘脂代謝重新連接，并伴隨著毒性神經(jīng)酰胺堆積以及線粒體損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激升高。在新生小鼠4周前，較高水平的Mettl3/m⁶A可作為制動(dòng)器，通過嚴(yán)格調(diào)控Smpd3，保護(hù)出生后的肝臟免受過度鞘脂積累和代謝紊亂的影響。這項(xiàng)研究擴(kuò)展了m⁶A修飾在維持發(fā)育階段肝臟代謝穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用，為新生兒健康和肝臟發(fā)育的理解提供了強(qiáng)有力的支持。

 

該研究由山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院袁得天、高等醫(yī)學(xué)院研究院李石洋、武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院夏宇塵以及德國(guó)海德堡癌癥研究中心 Mathias Heikenwalder 教授合作完成。山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士生王士冠、碩士生韓盼、青年教師孫建峰、深圳市呼吸疾病研究所研究員陳善澤為論文共同第一作者。

   

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