時間：2023-05-23 熱度：

基因表達調控是生物體內基因表達的調節(jié)控制，在疾病研究領域，基因表達調控幾乎是所有生物學過程的基礎。細胞水平上對目的基因的導入方式根據(jù)基因調控的時間長短可分為瞬時轉染和穩(wěn)定轉染，實驗中多會選擇穩(wěn)轉的方式構建穩(wěn)定表達細胞株，避免瞬轉效率不同以及瞬轉細胞傳代過程中目的基因丟失等原因對實驗造成誤差。

01

穩(wěn)定細胞株的構建方法

穩(wěn)定轉染原理：特定基因或干擾特定基因的序列整合至宿主的基因組染色體中，不會隨著細胞的增殖分裂而消失，在宿主細胞中可以穩(wěn)定表達目的序列。通常，人們借助慢病毒能夠整合序列到宿主基因組的能力來完成基因的穩(wěn)定表達或穩(wěn)定干擾。

 

構建穩(wěn)定株步驟如下（以Saos-2細胞為例）：

1) 細胞鋪板

將Saos-2細胞按30%匯合度接種到6孔板：

① Saos-2細胞配成2.0×10⁵cells/mL細胞懸液，待鋪板。

② 每孔鋪2mL，即4×10⁵cells/well，鋪1個6孔板。

2) 感染慢病毒

細胞鋪板后12-20h感染病毒

① 加病毒量計算方法：（細胞數(shù)×MOI值/病毒原液滴度）×10³=病毒用量（μL）

②加polybrene：細胞樣品中polybrene終濃度為5μg/mL。

③ 病毒感染12-20h后換培養(yǎng)基：棄去培養(yǎng)基，每孔加入2mL新鮮的培養(yǎng)基。

3) 穩(wěn)定株篩選

① 72h以后，加入終濃度2μg/mL puromycin。每隔2-3d換一次終濃度2μg/mL puromycin新鮮培養(yǎng)基。

② 藥物篩選約兩周后，拍熒光照片。

③ 穩(wěn)定細胞株鑒定和凍存。

注：其他細胞的polybrene濃度及抗生素濃度需要做預實驗進行確定。

  

02

不同基因調控策略的選擇

基因表達的調控可在多個層面上進行，包括基因水平、轉錄水平、轉錄后水平、翻譯水平和翻譯后水平的調控，九游會j9日常提及的基因調控多指基因及轉錄水平的上調和下調?；虻纳险{又可分為外源過表達和內源性激活CRISPRa（如表一），當目的基因序列過長，載體容量受限時多會選擇內源性激活的方式實現(xiàn)目的基因上調。CRISPRa是利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，突變Cas9蛋白切割DNA的活性位點,使Cas9蛋白喪失切割DNA功能但依然保留與DNA結合的能力——稱之為“d-Cas9”，d-Cas9連接激活元件（VP64）通過gRNA引導至目的基因的轉錄起始位點，便可實現(xiàn)目的基因的轉錄激活。

 

表一：外源過表達與內源性激活的區(qū)別

 

基因的下調一般都會采用RNA干擾（RNAi）技術，利用雙鏈RNA（dsRNA）高效、特異性降解細胞內同源mRNA從而阻斷靶基因表達。但RNAi技術對靶基因的消除是不完全的，若想完全消除需要借助CRISPR/Cas9技術實現(xiàn)基因的敲除，可根據(jù)實驗需求選擇RNAi或是基因敲除（如表二）。

 

表二：基因沉默兩種方式比較

 

基因下調也可以選擇內源性抑制CRISPRi策略，與CRISPRa的原理相似，“d-Cas9”與基因抑制結構域（KRAB結構域）融合表達，通過gRNA的引導可實現(xiàn)目的基因的轉錄抑制。CRISPRi策略的優(yōu)勢在于可以不改變內源基因組序列、有較高水平的基因抑制效果、特異性更強且適用編碼或非編碼等多種類型的基因。

 

選擇合適的基因調控策略，借助慢病毒載體整合基因的能力，快來構建穩(wěn)轉株吧！小編精心整理了九游會j9客戶應用不同調控基因策略的研究成果，以期為科研人er提供新的研究思路！

  

03

九游會j9客戶案例分享

1) 過表達＆干擾

文章標題：Hypoxia-induced circRNF13 promotes the progression and glycolysis of pancreatic cancer

研究內容：糖酵解（胰腺癌）

發(fā)表期刊：Exp Mol Med. IF：12.153

細胞類型：SW-1990（過表達circRNF13）/MIA PaCa-2（干擾circRNF13）

載體信息：pGLV31H1-Luci-circRNF13-OE/LV-shcircRNF13/LV-NC

克隆形成實驗檢測穩(wěn)定過表達或穩(wěn)定敲低circRNF13會正向調控PC細胞增殖(圖A-D)。穩(wěn)定細胞株構建腫瘤異種移植模型來驗證circRNF13在體內的作用。結果顯示，circRNF13過表達顯著加速腫瘤生長，腫瘤體積和最終腫瘤重量顯著增加(圖E-H)，而circRNF13敲低組的腫瘤體積和重量低于對照組(圖I-L)。皮下腫瘤組織的免疫組織結果表明，Ki-67在circRNF13過表達腫瘤中的表達高于對照腫瘤(圖M)。同時CD31（血管生成的生物標志物）陽性細胞在circRNF13過表達的腫瘤中的百分比高于對照腫瘤(圖M)。在circRNF13敲低的腫瘤中的結果與之相反。為了進一步確定circRNF13在PC血管生成中的功能，過表達circRNF13  SW-1990細胞的條件培養(yǎng)基增加了人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的管形成。相應地，敲低circRNF13 MIA PaCa-2細胞的條件培養(yǎng)基在很大程度上損害了血管生成能力(圖N)。綜上所述， circRNF13在PC增殖和血管生成中起重要作用。

圖1. CircRNF13在體外和體內促進PC增殖和血管生成

 

2) 內源性激活

文章標題：PTENα and PTENβ promote carcinogenesis through WDR5 and H3K4 trimethylation

研究內容：腫瘤發(fā)生機制

發(fā)表期刊：Nat Cell Biol. IF：28.231

細胞類型：293T（內源性激活USP9X）

載體信息：LV-dCas9-Puro，LV-gRNA（USP9X/WDR5/PTEN3/PTENα/β）

對50例肝癌患者的腫瘤組織和相應的癌旁組織進行免疫印跡檢測，發(fā)現(xiàn)PTENα/β與PTEN蛋白在肝癌中的表達不一致。與癌旁組織相比，在一些PTEN減少的腫瘤組織中，PTENα/β的表達保持不變，甚至增加(圖A，B)。PTENα和PTENβ對蛋白酶體介導的降解較PTEN更敏感。研究通過優(yōu)化電泳策略分離PTENα和PTENβ，發(fā)現(xiàn)PTENα和PTENβ都比PTEN更不穩(wěn)定(圖C)，蛋白酶體抑制劑MG132和PS341相較于溶酶體抑制劑NH4Cl或Brefeldin A顯著積累了PTENα/β (圖D)。Co-IP結合LC−MS/MS鑒定了3個E3連接酶或去泛素化酶(USP9X、USP7和TRIM28) 和PTENα相互作用的蛋白。通過干擾（shRNA）或敲除（CRISPR-Cas9）技術下調USP19在293T和Hela細胞中的表達會導致內源性PTENα/β的降低，而不影響PTEN的表達（圖E-G）。相反的是，瞬時過表達USP9X和通過CRISPR-dCas9對USP9X進行的穩(wěn)定轉錄激活均增加了293T細胞中的PTENα/β(圖H,I)，但未增加PTEN蛋白。綜上，USP9X正向調節(jié)PTENα/β，但不調節(jié)PTEN蛋白的表達。

圖2. PTENα和PTENβ在肝癌中的表達與PTEN蛋白不一致，且受USP9X的調控

 

3) 內源性抑制

文章標題：Human forebrain organoids-based multi-omics analyses reveal PCCB's regulation on GABAergic system contributing to schizophrenia

研究內容：精神分裂多組學分析

發(fā)表期刊：Research Square.

細胞類型：hiPSCs（內源性抑制PCCB）

載體信息：pLV-hU6-sgRNA-hUbC-dCas9-KRAB-T2a-Puro

PCCB編碼丙酰輔酶a羧化酶的β亞基參與丙酰輔酶a28分解代謝的線粒體酶，PCCB突變可通過破壞三羧酸(TCA)循環(huán)來損害線粒體能量代謝。用PCCB穩(wěn)定敲低的hiPSCs或對照hiPSCs產(chǎn)生的hFOs（Forebrain Organoid，大腦類器官）來研究敲低PCCB對功能的影響。結果顯示，在細胞氧化磷酸化中起作用的幾個線粒體基因MT-ND2、MT-ND5和MT-CYB，在PCCB-G1和PCCB-G2 hFOs中均下調(圖A)。同時，PCCB敲低降低了hFOs中的ATP生成，增加了ROS水平(圖B,C)，引起線粒體功能障礙。ELISA實驗證實PCCB敲低降低了琥珀酰輔酶a (SCOA)和α-KG(圖D,E)，當在hFOs的培養(yǎng)基中添加可轉化為GABA的上游代謝物α-KG (10 μg/ml)，發(fā)現(xiàn)在PCCB敲低的hFOs中GABA水平恢復(圖F)。研究表明，PCCB敲低通過減少TCA循環(huán)降低GABA水平(圖G)。

圖3. 敲低PCCB導致hFOs線粒體功能障礙

 

4) 單克隆敲除

文章標題：FBXO22 promotes leukemogenesis by targeting BACH1 in MLL-rearranged acute myeloid leukemia

研究內容：白血病

發(fā)表期刊：J Hematol Oncol. IF：23.168

細胞類型：THP-1人單核細胞白血病細胞（敲除FBXO22）

載體信息：pLenti-U6-gRNA-mCMV-SaCas9-P2A-sfGFP（gFBXO22）

為了研究Fbxo22缺陷抑制AML進展的分子機制，通過免疫共沉淀(IP)結合LC-MS/MS分析探討了Fbxo22在THP-1細胞中的相互作用。關注到氧化應激反應的調節(jié)因子BACH1為THP-1細胞中與FBXO22相互作用蛋白豐度最高的蛋白(圖A)。在THP-1細胞中可以檢測到內源性BACH1與FBXO22的相互作用(圖B,C)。THP-1細胞用CRISPR/Cas9敲除FBXO22后構建單克隆株，發(fā)現(xiàn)BACH1的蛋白水平顯著升高；shRNA敲低FBXO22使THP-1和MV4-11細胞中的BACH1穩(wěn)定；并證實BACH1蛋白的增加與抑制BACH1的HO-1蛋白的減少相關（圖D-F）。與此相反的是在THP-1細胞中，異位表達和誘導表達FBXO22顯著降低BACH1蛋白和/或增加HO-1的表達(圖G, H)。此外，放射線己酰亞胺(CHX)處理FBXO22敲除的THP-1細胞中BACH1蛋白的降低被顯著阻斷(圖I)。進一步驗證FBXO22是否通過蛋白酶體途徑降解BACH1，顯示，F(xiàn)BXO22的表達顯著降低了BACH1蛋白的表達，而BFA和NH4Cl對該作用無明顯影響，這表明FBXO22介導的BACH1降解受到蛋白酶體和CRL復合物調控（圖L），并且FBXO22增加內源性BACH1蛋白的泛素結合物的豐度，反之FBXO22敲除降低了THP-1細胞內源性BACH1泛素化(圖M,N)。這些結果表明，在MLLr AML細胞中，F(xiàn)BXO22與BACH1相互作用并促進BACH1的降解。

圖4. FBXO22在MLLr AML細胞中促進BACH1的降解

 

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