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在進(jìn)行分子表達(dá)操控中，經(jīng)常聽(tīng)到或使用到的一個(gè)技術(shù)便是Cre/Loxp或Flp/FRT重組酶系統(tǒng)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，這類重組酶系統(tǒng)是通過(guò)特異位點(diǎn)重組酶(Site-specific recombinases, SSRs)介導(dǎo)重組酶特異識(shí)別位點(diǎn)(Recombination tar-get sites, RTs)間的重組，來(lái)實(shí)現(xiàn)特異位點(diǎn)的基因敲除、基因插入、基因翻轉(zhuǎn)和基因易位等操作。由于該技術(shù)能夠有效克服其他類型重組技術(shù)的非特異性或重組效率低等缺點(diǎn)，近年來(lái)已逐漸在功能基因研究領(lǐng)域占據(jù)了主導(dǎo)地位。

Cre-loxP的基本原理

Cre（Cyclization Recombination Enzyme）是一種重組酶，來(lái)源于P1噬菌體，其基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1029bp，為38kDa大小的、由343個(gè)氨基酸組成的多肽單體蛋白。Cre重組酶的C-末端結(jié)構(gòu)域包含催化活性位點(diǎn)，能夠催化DNA分子中特定位點(diǎn)之間的重組，同時(shí)，Cre還能識(shí)別特異的DNA序列，即loxP位點(diǎn)，使兩個(gè)loxP位點(diǎn)間發(fā)生基因重組。

LoxP是Locus of X-overP1的縮寫，是位于P1噬菌體中長(zhǎng)度為34bp的一段序列，由兩個(gè)13bp的反向回文序列和8bp的中間間隔序列共同組成，反向回文序列是Cre重組酶的識(shí)別和結(jié)合區(qū)域，間隔序列決定LoxP序列的方向。

 

Cre/loxP誘導(dǎo)基因重組的方式

一般而言，當(dāng)細(xì)胞基因組內(nèi)存在兩個(gè)LoxP位點(diǎn)時(shí)，Cre重組酶會(huì)誘導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列發(fā)生重組。重組的結(jié)果取決于兩個(gè)loxP位點(diǎn)的方向，主要有以下幾種可能：
① 如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上且方向相同，Cre重組酶能有效地刪除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列（Deletion）（圖1A）；
② 如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上但方向相反，Cre重組酶能誘導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列翻轉(zhuǎn)（Inversion）（圖1B）；
③如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶能誘導(dǎo)兩條DNA鏈發(fā)生交換或染色體易位，即基因轉(zhuǎn)座（Translocation）（圖1C）
④如果四個(gè)loxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶能誘導(dǎo)loxP間的序列互換（cassette exchange）（圖1D）。

圖1 Cre-loxP誘導(dǎo)基因重組的方式

Cre-LoxP系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的操控，根據(jù)Cre重組系統(tǒng)誘導(dǎo)基因重組的方式，九游會(huì)j9可以通過(guò)如下三種策略實(shí)現(xiàn)Cre依賴的基因表達(dá)：

 

01 LSL序列（條件性基因選擇）

 

將LoxP2和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)盒（Transcription STOP cassette）插入啟動(dòng)子和目的基因之間，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)盒兩端各有一個(gè)同向的LoxP位點(diǎn)，組成LoxP-STOP-LoxP-gene模式，即LSL序列。

此情況下，在無(wú)Cre酶存在的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)盒下游靶基因完全不表達(dá)，但如果細(xì)胞中含有Cre酶，基因重組中的Deletion過(guò)程發(fā)生，移除轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)盒，進(jìn)而表達(dá)目的基因。這是一種簡(jiǎn)單有效的辦法，九游會(huì)j9可以通過(guò)LSL的設(shè)置，有選擇性地在某些細(xì)胞中表達(dá)基因。

圖2 Cre依賴的基因表達(dá)-LSL策略

 

02 DIO/DO序列

 

通過(guò)引入兩對(duì)不相容的反向Lox位點(diǎn)LoxP和Lox2272，經(jīng)過(guò)兩組Lox位點(diǎn)的兩輪重組可達(dá)到一種穩(wěn)定狀態(tài)。也就是可以通過(guò)Cre重組酶的存在與否來(lái)控制基因的表達(dá)。

這種策略被稱為DIO（Cre-on）或DO（Cre-off）。在這種策略下，任一對(duì)Lox位點(diǎn)間的序列會(huì)在Cre的作用下發(fā)生可逆的快速翻轉(zhuǎn)，之后Cre重組酶馬上不可逆地切割翻轉(zhuǎn)后的同向Lox位點(diǎn)，只留下翻轉(zhuǎn)后的基因和單獨(dú)的LoxP、Lox2272位點(diǎn)，防止基因的再次翻轉(zhuǎn)。這種巧妙的設(shè)計(jì)讓科研人員可以在病毒載體中構(gòu)建DIO和反向基因，感染Cre陽(yáng)性細(xì)胞后，可以讓Cre陽(yáng)性的細(xì)胞表達(dá)基因，是為DIO結(jié)構(gòu)；如果預(yù)先包裝的基因是正向，那么Cre陽(yáng)性的細(xì)胞則不表達(dá)基因，其余細(xì)胞表達(dá)基因，是為DO結(jié)構(gòu)。因此，人為操控基因表達(dá)變成了現(xiàn)實(shí)。

圖3借助LoxP和Lox2272的FLEX策略實(shí)現(xiàn)Cre依賴的基因表達(dá)
（Scott M. Sternson, et al., J. Neurosci., 2008）

 

03 MADM系統(tǒng)

雙標(biāo)記嵌合體分析MADM（mosaic analysis with the double markers）系統(tǒng)，是基于Cre誘導(dǎo)發(fā)生Translocation過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)同源重組將兩個(gè)相互嵌合的標(biāo)記基因（熒光蛋白）分別定位到同源染色體上的相同位點(diǎn)，位于同一條DNA鏈上的熒光蛋白N端（C端）和另一種熒光蛋白N端（C端）之間插入一個(gè)Loxp位點(diǎn)。在沒(méi)有Cre的情況下，不表達(dá)功能性的GFP或RFP；但在特定時(shí)期、特定細(xì)胞中表達(dá)Cre時(shí)，Cre能誘導(dǎo)帶有兩種不同熒光蛋白N端的DNA鏈與另一條帶有相同熒光蛋白C端的DNA鏈在細(xì)胞有絲分裂G2期發(fā)生重組，使得兩個(gè)子代細(xì)胞分別表達(dá)有任一種有功能性的熒光蛋白（稱為：X-segregation），或者其中一個(gè)子代細(xì)胞表達(dá)兩種熒光蛋白而另一種子代細(xì)胞不帶任何功能性熒光蛋白（稱為：Z-segregation）。另外，重組也可能發(fā)生在細(xì)胞周期的G1期或者G0期，在這種情況下，細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩種熒光蛋白。

圖4 MADM系統(tǒng)
（Zong Hui, et al., Cell., 2005）

 

Cre/loxp系統(tǒng)的應(yīng)用

通過(guò)病毒引入Cre或loxP元件，結(jié)合一種轉(zhuǎn)基因小鼠可達(dá)到對(duì)某類細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記或基因操作的目的。

 

LSL策略應(yīng)用

mT/mG（ROSA-pCA-loxp-mT-pA-loxp-mG-pA）鼠是一種雙熒光報(bào)告鼠，這種鼠在正常情況下表達(dá)定位在膜上的紅色熒光蛋白（TdTomato），而當(dāng)細(xì)胞表達(dá)Cre后，則表達(dá)定位在膜上的綠色熒光蛋白（GFP）。

Alb（血清蛋白）為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，將rAAV2/8-Alb-Cre病毒尾靜脈注射mT/mG小鼠，可發(fā)現(xiàn)特異性感染小鼠肝臟組織（綠色），而心臟組織未被感染（紅色）。

圖5肝臟組織（左）、心臟組織（右）

 

病毒產(chǎn)品	rAAV2/8-Alb-Cre
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物	mT/mG鼠
注射方式	尾靜脈注射
感染部位	肝臟組織
病毒用量	2E+11VG/只

 

管吉松教授團(tuán)隊(duì)將AAV-hSyn-Cre注射于 Ash1l^fl/fl小鼠右側(cè)AUD區(qū)條件性敲除Ash1l基因，發(fā)現(xiàn)Ash1l以細(xì)胞自主效應(yīng)的方式介導(dǎo)皮層神經(jīng)元的活動(dòng)依賴的突觸修剪過(guò)程。（點(diǎn)擊閱讀：Neuron | 拯救星星之子！上科大管吉松組揭示ASH1L單倍不足致小鼠自閉癥的神經(jīng)機(jī)制）。

圖6 AAV-Cre注射Flox小鼠實(shí)現(xiàn)條件性敲除
（Yan Yuze, et al., Neuron., 2022）

 

病毒產(chǎn)品	pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE pAAV-hSyn-Cre-WPRE
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物	Ash1lfl/fl小鼠
注射方式	腦定位注射
感染部位	小鼠右側(cè)腦AUD區(qū)
注射體積	300nL

 

DIO策略應(yīng)用

Thy1是錐體神經(jīng)元的特異性啟動(dòng)子，在前腦、海馬、杏仁核、丘腦及視網(wǎng)膜等區(qū)域均有豐富的表達(dá)， Thy1-cre鼠配合rAAV載體可在以上腦區(qū)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性標(biāo)記、光遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)操縱、在體鈣成像記錄，或者組織特異性的基因編輯。

圖7 AAV-DIO注射Thy1-Cre鼠實(shí)現(xiàn)特異性標(biāo)記

病毒產(chǎn)品	rAAV2/9-Ef1a-DIO-mCherry-WPRE
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物	Thy1-Cre小鼠
注射方式	腦定位注射
感染部位	小鼠雙側(cè)海馬
注射體積	200nL

 

運(yùn)用神經(jīng)示蹤技術(shù)對(duì)大腦特定神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行解析時(shí)，亦可以借助Cre重組酶系統(tǒng)和AAV血清型（比如rAAV2/9、rAAV2/retro、rAAV2/1）結(jié)合適用，達(dá)到特異性對(duì)神經(jīng)環(huán)路標(biāo)記和功能研究的目的。

圖8 Cre-DIO系統(tǒng)結(jié)合病毒示蹤技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)特異環(huán)路標(biāo)記及調(diào)控
（Ma Hui, et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2021）

 

病毒產(chǎn)品	rAAV2/Retro-CaMKIIα-mCherry-Cre rAAV2/9-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-GFP
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物	小鼠
注射方式	腦定位注射
感染部位	小鼠vCA1和pBLA
注射體積	200-300nL

 

MADM系統(tǒng)應(yīng)用

 

借助心肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子Tnnt2驅(qū)動(dòng)cre酶的表達(dá)，配合MADM-ML-11TG/GT鼠追蹤心肌細(xì)胞細(xì)胞分裂的狀態(tài)。（點(diǎn)擊閱讀：【Cell Stem Cell】雞尾酒療法促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖和心臟再生）。

圖9 MADM系統(tǒng)應(yīng)用
（Du Jianyong, et al., Cell Stem Cell., 2022）

 

病毒產(chǎn)品	pAdeno-Tnnt2-Cre
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物	P3 MADM-ML-11TG/GT鼠
感染部位	原代心肌細(xì)胞感染

 

Cre病毒列表（部分）

 

改造的Cre/loxP系統(tǒng)

經(jīng)過(guò)現(xiàn)代基因工程方法對(duì)Cre和loxP元件的改造，Cre/loxP系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了更加豐富的條件性重組策略。

1、對(duì)Cre元件的改造：對(duì)Cre元件的改造提高了Cre重組酶的活性，并且實(shí)現(xiàn)了藥物可誘導(dǎo)性。例如，通過(guò)在Cre元件上引入真核細(xì)胞核定位序列NLS，Cre重組酶能在低表達(dá)豐度下實(shí)現(xiàn)重組，這對(duì)于一些低豐度的啟動(dòng)子很重要。另外，在Cre元件的C端接上一段改造過(guò)的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域LBD，新的融合蛋白Cre-LBD將定位在胞漿內(nèi)，當(dāng)人工合成的激素分子結(jié)合到Cre-LBD受體后，蛋白構(gòu)象改變并進(jìn)入核內(nèi)，介導(dǎo)基因重組，目前使用最多的是tamoxifen誘導(dǎo)的CreERT2突變體，它的LBD來(lái)自于雌激素受體ER分子，當(dāng)有tamoxifen的時(shí)候，Cre才能介導(dǎo)基因重組，這樣通過(guò)控制tamoxifen的注射時(shí)間，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因重組時(shí)間特異性的調(diào)控。

圖10 tamoxifen誘導(dǎo)的Cre-ER系統(tǒng)
（Hyeonhui Kim, et al., Lab Anim Res., 2018）

2、遠(yuǎn)紅外光誘導(dǎo)的split Cre-loxP體系：化學(xué)誘導(dǎo)的Cre-loxP具有細(xì)胞毒性、泄漏、脫靶等劣勢(shì)，華東師范大學(xué)葉海峰研究員團(tuán)隊(duì)基于split-Cre重組系統(tǒng)和遠(yuǎn)紅外光(FRL)可誘導(dǎo)光遺傳系統(tǒng)建立了遠(yuǎn)紅外光誘導(dǎo)的split Cre-loxP體系(FISC，far-red light-induced split Cre-loxP system)。在該體系中，Cre酶被分為兩個(gè)片段，N端Cre融合到一個(gè)Coh2結(jié)構(gòu)（CreN-Coh2）；C端Cre融合到一個(gè)DocS結(jié)構(gòu)（DocS-CreC）;FRL光照時(shí)，Coh2和DocS在強(qiáng)親和力的作用下結(jié)合，從而Cre酶也被重新組合，行使功能。該體系實(shí)現(xiàn)了條件性非侵入的基因調(diào)控目的。（點(diǎn)擊閱讀：【Nat Commun.】華師大葉海峰團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新研究：非侵入性遠(yuǎn)紅外光誘導(dǎo)的Split-Cre系統(tǒng)調(diào)控基因重組）。

圖11 FISC體系
（Wu Jiali, et al., Nat Commun., 2020）

3、對(duì)loxP元件的改造：loxP元件也有一些突變體，間隔區(qū)和回文序列都可以進(jìn)行突變，突變后的序列依然能被Cre重組酶識(shí)別和重組，但是突變的loxP序列必須和同樣突變的loxP序列匹配介導(dǎo)基因重組，而不能和未突變的loxP序列匹配，這樣將不同的loxP序列組合用于控制多個(gè)基因（如上文所述的lox2272位點(diǎn)），在同一Cre重組酶的作用下，可以實(shí)現(xiàn)多序列的基因重組，產(chǎn)生非常多元的重組結(jié)果。例如彩虹腦（Brainbow）技術(shù)絢麗多彩的熒光標(biāo)記效果正式基于對(duì)loxP序列的改造實(shí)現(xiàn)。

 

其他重組酶系統(tǒng)

除Cre-LoxP系統(tǒng)外，類似的還有與Cre-LoxP系統(tǒng)無(wú)交叉影響的vCre-vLoxP、sCre-sLoxP系統(tǒng)，及Flp-FRT/F5系統(tǒng)和Dre-Rox1/Rox2系統(tǒng)，對(duì)應(yīng)的表達(dá)方案分別為fDIO和dDIO系統(tǒng)。多套重組酶體系的存在為研究中設(shè)計(jì)多個(gè)限制條件提供了便利，靈活應(yīng)用Cre、Flp、Dre重組酶系統(tǒng)將有助于更深入課題的開展（了解更多重組酶內(nèi)容，點(diǎn)擊閱讀：【知識(shí)分享】一半海水、一半火焰，分子表達(dá)操控中高頻出現(xiàn)的Cre、Flp、Dre等重組酶系統(tǒng)如何工作）。

 

圖12 Cre\Flp\Dre系統(tǒng)比較
（Lief E Fenno, et al., Nat Methods., 2014）

參考文獻(xiàn)

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