CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)具有廣泛的潛在未來應(yīng)用，包括癌癥治療_[1]。目前，CRISPR-Cas9技術(shù)的主要安全性問題是宿主對(duì)其組分的免疫反應(yīng)_[2-3]和脫靶問題_[4]。然而，該技術(shù)在RNA水平的安全性問題尚未得到評(píng)估。
 

RNA和MicroRNAs(miRNAs)之間存在廣泛的相互作用，不僅發(fā)生在mRNA的3’非翻譯區(qū)域，也發(fā)生在mRNA的氨基酸編碼序列(CDSs)中_[5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，一種長(zhǎng)鏈RNA可以通過“miRNA海綿”機(jī)制結(jié)合和吸附與其部分互補(bǔ)的miRNA，上調(diào)被這些miRNA抑制的靶基因_[6]。
 

近期，海軍軍醫(yī)大學(xué)王越團(tuán)隊(duì)、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院秦興軍/王業(yè)飛團(tuán)隊(duì)與美國(guó)南加州大學(xué)應(yīng)其龍團(tuán)隊(duì)合作在Molecular Cancer雜志上發(fā)表題為Optimization of Cas9 RNA sequenceto reduce its unexpected effects as a microRNA sponge的文章，文中研究了外源性長(zhǎng)鏈核酸物質(zhì)Cas9 RNA是否會(huì)通過miRNA海綿機(jī)制影響宿主細(xì)胞基因表達(dá)，并開發(fā)了RNA序列優(yōu)化策略，以提高該基因編輯系統(tǒng)的安全性_[7]。

結(jié)果

01  Cas9 RNA通過miRNA海綿機(jī)制影響細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)
 

為了分析Cas9對(duì)其細(xì)胞內(nèi)本身存在的microRNAs及其靶基因的調(diào)控作用，研究人員首先挖掘了一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包含過表達(dá)Cas9及其對(duì)應(yīng)親本對(duì)照的331個(gè)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組信息。作者使用miRanda軟件分析了Cas9 RNA和所有已知的人類miRNA之間的結(jié)合可能性。
 

研究人員將預(yù)測(cè)與Cas9 RNA結(jié)合可能性最高的51個(gè)miRNAs被命名“Cas9-miRNAs”(圖1A-B)，而69個(gè)不與Cas9結(jié)合的miRNAs被命名為“non-Cas9-miRNAs”。根據(jù)microRNA海綿假說，在某種細(xì)胞中引入Cas9后，某“Cas9-miRNA”的靶基因中，可能存在有更多靶基因表達(dá)水平上調(diào)的趨勢(shì)。研究者發(fā)現(xiàn)在這331個(gè)細(xì)胞系中，大多數(shù)“Cas9-miRNAs”的靶基因在更多的細(xì)胞中存在上述趨勢(shì)，符合microRNA海綿假說；而“non-Cas9-miRNAs”的靶基因就不存在這樣的趨勢(shì)。這個(gè)結(jié)果從CRISPR研究領(lǐng)域上講，提示Cas9的RNA可以通過microRNA海綿機(jī)制發(fā)揮作用；從RNA相互作用的的基礎(chǔ)機(jī)制角度上講，該研究利用幾百種細(xì)胞系中，單一的，相同干預(yù)設(shè)計(jì)的大樣本數(shù)據(jù)證明了microRNA海綿機(jī)制本身的普遍性，雖然在很多細(xì)胞中這種效應(yīng)并不是非常強(qiáng)。
 

在聯(lián)合分析miRNA基礎(chǔ)表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（CCLE）中的數(shù)據(jù)后，研究者發(fā)現(xiàn)在所有的Cas9-miRNA中，Let-7i是大多數(shù)細(xì)胞中主要表達(dá)的Cas9-miRNA。且Let-7家族成員是眾所周知的腫瘤抑制miRNA，因此研究者后續(xù)研究將注意力集中在了Cas9的RNA對(duì)let-7家族及其下游靶基因的研究中。通過qPCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)，研究人員證實(shí)了在更多類型的細(xì)胞中引入Cas9后，一些驗(yàn)證過的let-7靶基因表達(dá)上調(diào)(U251, 786-O, T98G v.s. MCF7) (圖1I-J) 。
 

此外，研究者還將let-7i的靶基因變化符合microRNA海綿假說趨勢(shì)的細(xì)胞定義為let-7i相關(guān)Cas9敏感細(xì)胞，反之為let-7i相關(guān)Cas9不敏感細(xì)胞；對(duì)比這兩類細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，miRNA本身的表達(dá)量和靶基因的基礎(chǔ)表達(dá)量，以及靶基因的突變狀態(tài)都會(huì)影響Cas9的RNA發(fā)揮microRNA海綿效應(yīng)。這不僅有助于評(píng)價(jià)Cas9在某種細(xì)胞中是否通過microRNA海綿效應(yīng)發(fā)揮作用，也為更廣泛的microRNA海綿效應(yīng)是否存在于某種細(xì)胞提供一定預(yù)判參考。
 

進(jìn)一步，作者分析了其他幾種Cas9 RNA通過microRNA海綿機(jī)制參與let-7家族靶基因的調(diào)控，通過RNA-pulldown實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cas9 RNA可以直接結(jié)合let-7(圖1N)，并且證實(shí)在一些腫瘤細(xì)胞中，一些let-7靶基因在Cas9導(dǎo)入后有一定程度上調(diào)，如CDK6、KRAS、FN1和HMGA(圖1O)。在Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠中，雖然在大多數(shù)作者檢測(cè)的組織中沒發(fā)現(xiàn)顯著差異，但在少數(shù)組織中存在let-7靶基因上調(diào)的現(xiàn)象。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cas9 RNA在某些類型的細(xì)胞中可以通過miRNA海綿機(jī)制調(diào)控let-7靶基因，提示Cas9表達(dá)系統(tǒng)本身可能通過DNA裂解以外的機(jī)制影響細(xì)胞。
 

圖1 Cas9 RNA通過miRNA海綿機(jī)制影響細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)

02  Cas9 RNA序列優(yōu)化降低其對(duì)細(xì)胞增殖和let?7下游基因的影響
 

Let-7下游靶基因大部分為癌基因，由于Cas9可以調(diào)控一些let-7靶基因的表達(dá)，研究人員推測(cè)外源引入Cas9可能會(huì)影響細(xì)胞的生物學(xué)特性。作者將Cas9病毒載體和對(duì)照病毒轉(zhuǎn)入人前列腺癌細(xì)胞系DU145，發(fā)現(xiàn)Cas9在細(xì)胞計(jì)數(shù)中輕度促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞集落形成（圖1A）。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，研究人員也發(fā)現(xiàn)Cas9輕度促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖2B)。
 

Cas9 RNA可以通過miRNA海綿機(jī)制輕微促進(jìn)某些細(xì)胞的增殖，提示除了降低CRISPR-Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)外，有必要通過修改Cas9本身的RNA來提高CRISPR-Cas9技術(shù)的安全性。為了進(jìn)一步證實(shí)這一miRNA海綿機(jī)制的存在且在RNA水平上優(yōu)化Cas9序列，研究人員構(gòu)建了一個(gè)同義突變質(zhì)粒Cas9-Mut，在三個(gè)let-7結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，而Cas9-mut的mRNA轉(zhuǎn)錄本可以被翻譯成與Cas9相同的氨基酸序列(圖2F)。HEK293細(xì)胞的RNA-pulldown實(shí)驗(yàn)顯示，Cas9-mut與let-7的結(jié)合比Cas9明顯減少(圖2G)。
 

研究人員發(fā)現(xiàn)，在DU145細(xì)胞(圖2J-K)和U251細(xì)胞中(圖2L)，Cas9-mut上調(diào)let-7靶基因的能力也明顯弱于Cas9。研究者將Cas9-Mut質(zhì)：桶邢騏BXN4基因的gRNA轉(zhuǎn)入DU145細(xì)胞，進(jìn)一步測(cè)試證實(shí)了Cas9-Mut的基因編輯能力(圖2O)，為其在實(shí)際應(yīng)用中提供了支持。
 

圖2Cas9 RNA序列優(yōu)化降低其對(duì)細(xì)胞增殖和let?7下游基因的影響

結(jié)論

研究人員通過生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cas9的RNA可以通過miRNA海綿機(jī)制與內(nèi)源性miRNA相互作用，Cas9 RNA可以通過結(jié)合let-7，上調(diào)一些let-7的靶基因，并在某些細(xì)胞類型中輕度促進(jìn)細(xì)胞增殖。通過同義突變let-7結(jié)合位點(diǎn)，可以優(yōu)化Cas9的RNA序列，削弱其對(duì)細(xì)胞增殖和部分let-7下游基因的表達(dá)的促進(jìn)作用。研究者從新的維度認(rèn)識(shí)了CRISPR/Cas9技術(shù)的安全性問題，并提出了解決方案，提供了在RNA水平上優(yōu)化的更安全的CRISPR/Cas9技術(shù)， 有一定的應(yīng)用前景。


海軍軍醫(yī)大學(xué)的蔣俊鋒，曾韜，張莉和范杏飛為文章的第一作者。
 

參考文獻(xiàn)：

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[6]Xiao G, et al. The long noncoding RNA TTTY15, which is located on the Ychromosome, promotes prostate Cancer progression by sponging let-7.Eur Urol. 2019;76(3):315–26.

[7]Junfeng Jiang,et al.Optimization of Cas9 RNA sequenceto reduce its unexpected effects as a microRNAsponge.Mol Cancer.2022 Jun 24;21(1):136.doi: 10.1186/s12943-022-01604-x.