2022年5月的春風拂面而過，不知不覺中深埋在口罩里的高材生們，就到了一年的畢業(yè)季，此時很多應屆畢業(yè)的碩博都忙著寫文章投文章，搞的焦頭爛額，想要在畢業(yè)前的一點時間里做出屬于自己的學術成果。然而也有一些人，早早就拿到了文章接收函，此時正在跟自己的紅顏知己享受校園青春中最純粹的一段快樂時光。是因為實驗不努力么？是因為科研的敏感性差么？其實都不是的，在我看來，最大的原因在于不了解腫瘤方向發(fā)文章的“套路”。
為了解決這個問題，微風在這里選擇2022年5月發(fā)表在《CANCER GENE THERAPY》雜志，題為“CRISPR/Cas9-mediated knockout of PIM3 suppresses tumorigenesis and cancer cell stemness in human hepatoblastoma cells”的文章[1]，與大家一起共同品味腫瘤研究中的“套路”。
01 背景介紹
肝母細胞瘤是一種具有多種分化方式的惡性胚胎性腫瘤。它是由胎兒性上皮性肝母細胞，胚胎性細胞以及分化的間葉成分組成，這種疾病多發(fā)生于小兒。對于此類腫瘤，手術切除是最為有效的治療方法，如果腫瘤是單發(fā)的、瘤體較小、位置表淺且無肝外轉移，手術切除可獲治愈。但是超過半數(shù)的患者在就診的時候就失去了手術機會。并且肝母細胞瘤對放療和化療均不敏感，因此找尋致病進程中的關鍵基因，克服現(xiàn)有治療方式的瓶頸顯得至關重要。
CRISPR/Cas9單克隆敲除株，是利用單鏈導向RNA通過堿基互補配對的原理靶向基因的結合位點，隨后Cas9核酸內切酶結合到與單鏈導向RNA形成雙鏈的基因區(qū)域進行切割。切割形成的雙鏈DNA斷裂在細胞內被修復，造成基因敲除的主要修復機制是非同源末端連接NHEJ，這種修復將產(chǎn)生短的核酸插入或者刪除從而導致基因移碼突變。目前構建單克隆細胞株的方式主要有電轉Cas9蛋白和gRNA、瞬轉Cas9-gRNA質粒、慢病毒侵染、轉座子構建 4種方式，目前主流的敲除株服務公司和高校及研究所的各個課題組，主要使用的是前3種方法。
圖1.CRISPR/Cas9敲除原理[2]
02 技術思路
（1）使用CRISPR/Cas9敲除技術構建HuH6細胞PIM6敲除單克隆細胞系，體外檢測增殖、周期、凋亡、遷移、侵襲等常規(guī)功能學。
（2）使用傳統(tǒng)的RNA-seq技術，確定PIM3敲除后下游信號通路的變化。
（3）使用過表達質粒，扭轉PIM3敲除，進行細胞功能學檢測。
（4）驗證PIM3敲除后，對于HuH6細胞干性的影響。
（5）體內實驗驗證PIM3敲除對于HuH6細胞皮下增殖能力的影響。
03 研究內容
作者首先通過瞬轉Cas9和gRNA表達載體的方式，構建了HuH6 PIM3KO單克隆細胞株。并通過Western Blot鑒定敲除細胞株的PIM3表達，選擇B11、D2、E8 3個敲除單克隆進行后續(xù)功能研究。作者分別使用了CTG法檢測細胞增殖、臺盼藍法檢測細胞存活、transwell法檢測細胞的遷移和侵襲能力、流式檢測了細胞的周期變化。
圖2.PIM3細胞功能檢測
作者通過轉錄組測序的方式，發(fā)現(xiàn)PIM3KO后，共有746個基因發(fā)生了顯著性表達改變，其中378個差異基因上調，368個差異基因下調。通過IPA分析，PIM3KO明顯出現(xiàn)了細胞死亡和分化基因的上調。其中CCR5信號通路是下調最為明顯的，而此通路已經(jīng)明確證實可誘導癌細胞歸巢到轉移部位來促進腫瘤進展。除此之外，發(fā)現(xiàn)了一些細胞分化通路的激活，如FXR/RXR和LXR/RXR，這也證明了PIM3具有調節(jié)肝母細胞瘤去分化的功能。
圖3.轉錄組測序結果
作者使用過表達載體，在PIM3KO的細胞中做了回復，發(fā)現(xiàn)回復PIM3基因表達后，細胞增殖速度明顯增加，而遷移和侵襲能力也明顯得到了回復，證明PIM3的功能是真實可信的。
圖4.回復實驗
由于在轉錄組測序的結果中發(fā)現(xiàn)PIM3基因與細胞去分化有關，因此作者想驗證一下PIM3基因與腫瘤干性的關系，首先文章鑒定了干性最常規(guī)的指標CD133并通過成球實驗證實PIM3KO后明顯降低HuH6細胞干性。同時也測定了其他干性的biomarker，例如Oct4、Nanog、Sox2、Nestin，證實了PIM3確實影響腫瘤干性。
圖5.PIM3基因影響腫瘤干性
至此，作者完成了所有體外實驗，但是由于文章完整性的要求，又進行了體內實驗的檢測。首先構建了皮下移植瘤模型，測量了生長曲線和生存曲線，并用免疫組化檢測了KI67的表達，確定了PIM3KO后，會影響腫瘤的在體增殖。
圖6.PIM3基因功能在體驗證
總結一下，通篇文章只是證明了PIM3在肝母細胞瘤中的作用和機制這件很簡單的事情，就發(fā)表了影響因子在6分左右的文章。它值得學習的地方在于設計的套路，使用單克隆敲除株探索基因功能，使用測序發(fā)掘通路差異，最后再進行通路檢測和回復實驗，套路化明顯，思路直白清晰，非：鮮仕妒坎┦棵悄７，快速發(fā)表文章。
參考文獻
[1]Raoud Marayati, Laura L. Stafman et al.CRISPR/Cas9-mediated knockout of PIM3 suppresses tumorigenesis and cancer cell stemness in human hepatoblastoma cells.Cancer Gene Ther. 2022 May ; 29(5): 558–572. doi:10.1038/s41417-021-00334-4.
[2]TianzuoZhan,NiklasRindtorff et al. CRISPR/Cas9 for cancer research and therapy.Seminars in Cancer Biology Volume 55, April 2019, Pages 106-119，doi：org/10.1016/j.semcancer.2018.04.001.
