時間：2022-05-30 熱度：

前言

2022年1月美國華盛頓大學(xué)Jennifer Davis研究團(tuán)隊在Cell Stem Cell上發(fā)表題目為“MBNL1 drives dynamic transitions between fibroblasts and myofibroblasts in cardiac wound healing”的心血管研究文章，該研究發(fā)現(xiàn)心臟創(chuàng)傷后愈合過程中MBNL1能夠驅(qū)動成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞之間的動態(tài)轉(zhuǎn)換。該發(fā)現(xiàn)為逆轉(zhuǎn)心臟創(chuàng)傷后心肌纖維化的進(jìn)程提供了新的解決思路。

背景介紹

心臟疾病的核心問題是健康的心肌組織被纖維化的疤痕組織所替代。雖然創(chuàng)傷后自我修復(fù)形成的瘢痕可防止心肌梗死后心臟破損，但它會引起血流動力學(xué)障礙和心律失常最終導(dǎo)致心臟衰竭。：鄣男緯稍從赥cf21和Pdfgra系的心臟固有成纖維細(xì)胞的動態(tài)變化，這些成纖維細(xì)胞在損傷后增殖，然后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。有研究表明，肌成纖維細(xì)胞的狀態(tài)實際上是不穩(wěn)定和可逆的，取決于前纖維性刺激后未知分子機(jī)制的運(yùn)作。

MBNL（musclebind-like protein）盲肌樣蛋白家族是一類RNA結(jié)合蛋白，MBNL1通過穩(wěn)定、剪接、聚腺苷酸化和定位靶mRNA調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。有研究表明肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良以及紅細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞發(fā)育缺陷與MBNL1介導(dǎo)的創(chuàng)傷后愈合失調(diào)有關(guān)。MBNL1基因敲除的小鼠損傷后肌成纖維細(xì)胞密度和纖維化疤痕均降低。

在成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的過程中，所需的轉(zhuǎn)錄本如血清反應(yīng)因子（SRF）和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CnA）被MBNL1穩(wěn)定或交替拼接。這些研究均表明MBNL1在促進(jìn)心臟纖維化狀態(tài)和纖維化中起著重要的作用。

        

亮點要素

1.MBNL1調(diào)控心臟成纖維細(xì)胞終態(tài)并調(diào)節(jié)：坌緯珊統(tǒng)墑
2.MBNL1調(diào)節(jié)心肌梗死誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞的增殖
3.MBNL1是誘導(dǎo)和維持成熟的肌成纖維細(xì)胞狀態(tài)的關(guān)鍵分子
4.MBNL1能夠穩(wěn)定成纖維細(xì)胞激活（纖維化）狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄本

研究思路

• 通過批量的轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)MBNL1在激活的肌成纖維細(xì)胞中上調(diào)，并在心肌梗死修復(fù)過程中與成纖維向肌成纖維細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變相符合，確定MBNL1在細(xì)胞動態(tài)轉(zhuǎn)換之間起到重要作用。（確定基因）

• 構(gòu)建MBNL1過表達(dá)心臟成纖維細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)基因鼠與MI模型鼠，F(xiàn)ACS分選心臟成纖維細(xì)胞并測序，發(fā)現(xiàn)MBNL1能夠使肌成纖維細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本上調(diào)。又在MBNL1過表達(dá)的基礎(chǔ)上構(gòu)建MI模型小鼠，采用膠原及增殖熒光染色等方法，明確了MBNL1抑制MI誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖并穩(wěn)定：鄣淖饔。（基因up驗證）

• 構(gòu)建MBNL1條件性敲除小鼠，通過染色及心臟超聲發(fā)現(xiàn)MBNL1缺失在心梗情況下減少纖維化及肌成纖維細(xì)胞增殖、減輕心室擴(kuò)張、改善收縮功能。與對照小鼠相比，敲除小鼠成纖維細(xì)胞分化缺陷且纖維化：圩櫓緯剎渙，又通過感染過表達(dá)SRF腺病毒恢復(fù)了轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的能力。（基因down驗證）

• 對MBNL1缺失的MI小鼠心臟進(jìn)行單細(xì)胞測序分析各細(xì)胞發(fā)展情況，發(fā)現(xiàn)MBNL1缺失后MI小鼠心臟重新部署了損傷后修復(fù)的體系。其中與纖維化有關(guān)的基因下調(diào)，與EMT及心外膜發(fā)育有關(guān)的上調(diào)，提示了無MBNL1在損傷后修復(fù)中的優(yōu)勢。（單細(xì)胞宏觀動態(tài)分析）

• 為了探究MBNL1的作用機(jī)制，對結(jié)合因子、分化誘導(dǎo)基因以及M基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行挖掘。發(fā)現(xiàn)Sox9滿足條件且是EMT和肌成纖維細(xì)胞形成的必需轉(zhuǎn)錄因子并進(jìn)行mRNA衰減實驗驗證。（探索機(jī)制）

 

研究內(nèi)容

對4、14、28天的心梗小鼠肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行批量的轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)在梗死修復(fù)過程中，肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的動態(tài)變化與成纖維細(xì)胞增殖、肌成纖維和母纖維細(xì)胞的相互轉(zhuǎn)變相符合。在損傷修復(fù)過程中，參與正常成纖維細(xì)胞功能的基因下調(diào)，與ECM相關(guān)的基因上調(diào)，細(xì)胞周期基因先高表達(dá)再下降，提示了成纖維細(xì)胞先增殖又被抑制的情況。為了比較靜止和激活的心臟成纖維細(xì)胞之間的基因表達(dá)差異，構(gòu)建了它莫昔芬誘導(dǎo)的熒光報告轉(zhuǎn)基因小鼠標(biāo)記激活的成纖維細(xì)胞。FACS分離兩種狀態(tài)的細(xì)胞并檢測，發(fā)現(xiàn)MI后postn追蹤的激活成纖維細(xì)胞中代表性肌成纖維細(xì)胞基因（Col1a1、Acta2等）顯著上調(diào)，并且MBNL1基因表達(dá)在第4天和第14天在激活的肌成纖維細(xì)胞中也升高。證明了MBNL1活性與損傷后修復(fù)的肌成纖維細(xì)胞的形成有關(guān)。

為了驗證MBNL1過表達(dá)是否能將心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，研究者構(gòu)建了特異性過表達(dá)MBNL1轉(zhuǎn)基因小鼠。對其心臟成纖維細(xì)胞測序分析，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MBNL1的小鼠成纖維細(xì)胞中上調(diào)的一些轉(zhuǎn)錄本是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性基因，與梗死的對照小鼠的成纖維細(xì)胞狀態(tài)相似，這表明了MBNL1的過表達(dá)能將正常成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為心梗后成纖維細(xì)胞的類似狀態(tài)。雖然狀態(tài)相似，但心臟纖維化、aSMA+肌成纖維細(xì)胞數(shù)量或心臟結(jié)構(gòu)功能方面差異不明顯，研究者推測需要額外的刺激來實現(xiàn)生理性肌成纖維細(xì)胞的表型。隨后應(yīng)用了TGF-β處理增加aSMA+應(yīng)力纖維，并聯(lián)合SRF處理增加硬度。在該過程中發(fā)現(xiàn)SRF作用于MBNL1的下游，敲低SRF會阻斷了TGF-β介導(dǎo)的過表達(dá)MBNL1心臟成纖維細(xì)胞的分化。

圖2.心臟成纖維細(xì)胞特異性MBNL1過表達(dá)誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞表型

為了建立纖維化表型，對MBNL1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行心肌梗死手術(shù)發(fā)現(xiàn)MI顯著上調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠心臟成纖維細(xì)胞中的幾個典型膠原基因。CLIP-seq結(jié)果顯示MBNL1定位在膠原和纖維連接蛋白等分泌因子上，并且在MI一段時間后過表達(dá)MBNL1的心臟：塾攵哉兆橄啾雀墑，可能是由于Tg心臟成纖維細(xì)胞中有關(guān)基質(zhì)成熟因子（Lox和Runx1）的過表達(dá)。通過染色測量PDGFRa+、EdU+細(xì)胞的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，Tg小鼠成纖維細(xì)胞的增殖能力與對照相比顯著降低；RNA-seq分析顯示，MI后Tg心臟成纖維細(xì)胞中陽性細(xì)胞周期調(diào)控因子均下調(diào)，而細(xì)胞周期抑制因子顯著上調(diào)，可能是由于過表達(dá)MBNL1誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡或抑制傷口愈合的增殖期限制了成纖維細(xì)胞數(shù)量。這些數(shù)據(jù)表明，過表達(dá)MBNL1小鼠成纖維細(xì)胞增殖減少阻止了MBNL1表達(dá)和MI損傷對肌成纖維細(xì)胞密度和：凵傻牡加效應(yīng)。

圖3.心肌成纖維細(xì)胞中過表達(dá)MBNL1可阻止MI依賴性的成纖維細(xì)胞增殖

 

構(gòu)建MBNL1心臟成纖維特異性敲除小鼠，以檢測MBNL1對心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的重要性。正常心臟成纖維細(xì)胞特異性MBNL1缺失不影響心臟功能，但在心肌梗死后，MBNL1缺失小鼠心室不擴(kuò)張、收縮功能有所改善且纖維化和肌成纖維細(xì)胞密度降低了40%，表明MBNL1是肌成纖維細(xì)胞形成和纖維化所必需的。Col5a1在MBNL1缺失心臟中顯著下調(diào)且其ECM中的未成熟膠原纖維較多，膠原纖維寬度和排列也減少，表明MBNL1缺失導(dǎo)致MI后心臟：鄯⒂懷墑旌筒晃榷?。由于TGF-β處理能夠模擬MI后纖維化形成aSMA+應(yīng)力纖維，采用SRF腺病毒感染TGF-β處理的成纖維細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：能夠被MBNL1穩(wěn)定的SRF可以拯救TGF-β介導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化。證明了MBNL1及其下游調(diào)控靶點發(fā)揮作用，成纖維細(xì)胞就能夠進(jìn)行程序化狀態(tài)轉(zhuǎn)換，由此說明了MBNL1在轉(zhuǎn)換中的重要性。

圖4.MBNL1是心臟成纖維細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變和纖維化：坌緯傷匭璧

EMT調(diào)控基因表達(dá)的改變并不能確定是由于MBNL1在成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換或心外膜重新激活中的作用。研究者對正：蚆I心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA-seq (scRNA-seq)測序，發(fā)現(xiàn)在MBNL1缺失小鼠中，同時高度表達(dá)Sca1和Pdgfra的靜止成纖維細(xì)胞簇顯著增加，這表明MBNL1缺失的靜止成纖維細(xì)胞簇此時具備了心臟間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。而且超過一半的MBNL1缺失心臟成纖維細(xì)胞位于較大的激活肌成纖維細(xì)胞簇中，許多用于結(jié)合拼接的轉(zhuǎn)錄本均直接結(jié)合并受MBNL1調(diào)控。當(dāng)MI后，MBNL1缺失將60%的心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟狀態(tài)，說明MBNL1與MI同時作用將靜止的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換為成熟的肌成纖維細(xì)胞狀態(tài)。心肌梗死后MBNL1功能喪失的影響更為顯著，因為整個心臟成纖維細(xì)胞群仍處于靜止?fàn)顟B(tài)，所以MBNL1對于成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)換起到?jīng)Q定性作用。

圖5.scRNA-seq顯示MBNL1在成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞之間起著轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)換的作用

 

為了評估MBNL1調(diào)控的轉(zhuǎn)錄本在MI后驅(qū)動心臟成纖維細(xì)胞狀態(tài)時的變化，研究者進(jìn)一步挖掘了三個數(shù)據(jù)集：MBNL1結(jié)合、肌成纖維細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子、以及MI后MBNL1缺失心臟成纖維細(xì)胞中下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本。發(fā)現(xiàn)Sox9是同時滿足三個條件的關(guān)鍵性因子，它是EMT和肌成纖維細(xì)胞形成必需的轉(zhuǎn)錄因子。在MI損傷后，Sox9在野生型Postn+肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)增加了8.5倍，且相對于靜止的成纖維細(xì)胞，Sox9的表達(dá)仍保持升高。相反，在梗死的MBNL1缺失的心臟中，Sox9+和PDGFRa+成纖維細(xì)胞的百分比降低了2.5倍。將Sox9轉(zhuǎn)染到心臟成纖維細(xì)胞中，足以在體外誘導(dǎo)成aSMA+肌成纖維細(xì)胞，表明單獨(dú)Sox9可促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞狀態(tài)，并可修復(fù)MBNL1缺失的成纖維細(xì)胞分化缺陷。已有的研究表明MBNL1結(jié)合并調(diào)控Sox9，由于Sox9與MBNL1的表達(dá)同時上調(diào)，研究者推測MBNL1可以穩(wěn)定Sox9的轉(zhuǎn)錄。為了驗證這一假設(shè)，對心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行了mRNA衰減檢測，并用腺病毒轉(zhuǎn)染MBNL1 挽救了Sox9的表達(dá)，這個操作減緩了兩個基因型介導(dǎo)的衰減率。這表明心肌梗死后，MBNL1穩(wěn)定心臟成纖維細(xì)胞中的Sox9轉(zhuǎn)錄本，以促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。

圖6.MBNL1穩(wěn)定Sox9并促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的形成

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